維生素E琥珀酸酯誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的雄激素不敏感的前列腺癌PC-3細(xì)胞，觀察VES對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，對(duì)這些作用可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討，為VES應(yīng)用于臨床治療前列腺癌提供理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果： 1、VES對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用的觀察本部分研究首先用不同濃度的VES作用于體外培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞，分別在不同時(shí)間后采用噻唑蘭(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。用20μg/ml濃度的VES作用PC-

2、3細(xì)胞不同時(shí)間后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。結(jié)果表明，VES可以顯著抑制PC-3細(xì)胞的增殖，這種抑制作用隨著藥物濃度和作用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯，在40μg/ml的濃度下，作用72小時(shí)后的抑制率達(dá)到了85.5％，光鏡下可以觀察到細(xì)胞密度降低。流式細(xì)胞儀分析，PC-3細(xì)胞的自然凋亡率是0.7％，G1、S、G2/M期的比例分別是70.70％、17.58％、11.72％。20μg/mlVES的培養(yǎng)液作用24、48、72小時(shí)之后的細(xì)胞凋亡率是

3、6.03％、16.45％、20.41％。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，S期細(xì)胞明顯減少而G2/M期細(xì)胞明顯增加。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3細(xì)胞表面Fas抗原的表達(dá)PC-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，以不同濃度VES作用24、48、72h。處理結(jié)束后收集離心，加入PE標(biāo)記的抗人Fas抗體，流式細(xì)胞儀分析陽性表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，未經(jīng)藥物作用的PC-3細(xì)胞表面Fas表達(dá)陽性率和平均熒光強(qiáng)度分別為11.2％和2.14；VES作用24h后，陽

4、性表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度即升高，隨著濃度和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)as的表達(dá)陽性率和平均熒光強(qiáng)度明顯增加，呈現(xiàn)明顯的濃度-時(shí)間依賴性。 3、ELISA檢測(cè)藥物作用前后TGF-β<,1>的水平變化在96孔板中培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，加入各濃度的YES培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24～72h，離心后收集上清。按試劑盒說明將標(biāo)本加入被覆抗體的96孔板，孵育4h，以辣根過氧化酶+TMB為顯色劑，在450nm測(cè)定吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光曲線比較，計(jì)算TGF-β濃度

5、。結(jié)果表明未經(jīng)藥物作用的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β濃度約為1.3ng/ml，隨著時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增加，TGF-β濃度明顯增高，最高可達(dá)5倍。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)VES作用前列腺癌PC-3細(xì)胞后的各種觀察和實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了VES對(duì)雄激素不敏感的前列腺癌PC-3細(xì)胞有明顯的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用并能使PC-3細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯。這種作用與VES的濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)的關(guān)系。這種凋亡誘導(dǎo)作用可能跟VES能誘導(dǎo)PC

6、-3細(xì)胞胞膜上的Fas死亡受體表達(dá)升高有關(guān)。以往有研究表明，PC-3細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間暴露于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)后能產(chǎn)生對(duì)其抑制生長(zhǎng)的抵抗力，在培養(yǎng)液中加入純化的TGF-β只能輕度抑制PC-3細(xì)胞的增殖。這種對(duì)TGF-β的抵抗作用可能與PC-3細(xì)胞在惡變過程中部分受體表達(dá)出現(xiàn)缺失而導(dǎo)致對(duì)TGF-β不敏感有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，VES作用后PC-3細(xì)胞的TGF-β的表達(dá)水平顯著提高，這說明，VES除了通過增加TGF-β的分泌來抑制PC-3細(xì)胞