能量代謝異常與髓性白血病化療耐受的研究.pdf

1、研究背景：
　　 白血病細胞耐藥是髓性白血病治療中的一大障礙，是治療失敗的主要原因之一。多藥耐藥可通過P糖蛋白、多藥耐藥性相關(guān)蛋白、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ、肺抗藥性相關(guān)蛋白介導的多藥耐藥基因的表達而改變。進一步研究白血病的化療耐藥機制，尋找新的治療靶點，增強化療敏感性、克服耐藥，具有十分重要的臨床應(yīng)用價值。
　　 代謝組學可對生物或細胞代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系，而越來越受到人們的重視。研究者

2、利用代謝組學技術(shù)探索格列衛(wèi)(IM)耐藥與敏感的慢粒白血病(CML)細胞的代謝物差異，為IM耐藥的治療提供新靶向和新思路。結(jié)果表明:IM耐藥與細胞增高的糖酵解活性和磷脂翻轉(zhuǎn)有關(guān);對IM耐藥的K562-r和LAMA84-r細胞保持了增高的葡萄糖攝取和乳酸生成的高糖酵解代謝表型。
　　 糖酵解活性與腫瘤生成及對放化療的耐受呈正相關(guān)。通過抑制糖酵解酶的活性，可阻斷糖酵解的進行，從而使得腫瘤細胞因能量供應(yīng)缺乏而死亡，但正常細胞不受影響。研

3、究表明，僅依靠抑制有氧糖酵解，并不足以產(chǎn)生顯著的具有臨床意義的抗腫瘤作用。這可能是由于ATP的耗竭只有達到一定的閾值才能啟動細胞的凋亡或壞死程序，最終導致細胞的死亡。
　　 近來大規(guī)模的基因表達分析表明在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中編碼糖酵解途徑分子的基因選擇性表達上調(diào)。研究證實在血液腫瘤細胞中，亦存在糖酵解異?，F(xiàn)象。3溴丙酮酸(3-BrPA)可有效誘導了多藥耐藥急性髓系白血病(AML)細胞株HL-60/AR的凋亡，提示阻斷細胞的能量供應(yīng)

4、有可能克服血液腫瘤細胞多藥耐藥性。潑尼松龍耐藥與急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞高葡萄糖消耗明顯相關(guān)，通過抑制糖酵解可使對潑尼松龍耐藥的ALL原代細胞和細胞株對糖皮質(zhì)激素重新敏感，這種增敏作用可通過細胞重要的能量傳感系統(tǒng)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來調(diào)控。糖酵解的抑制可活化AMPK，導致mTOR的抑制，進而使抗凋亡蛋白Mc1-1表達下調(diào)。
　　 目前尚未有糖酵解抑制劑聯(lián)合化療用于髓性白血病化療增敏的報道。本研究以髓性白血病耐藥

5、細胞能量代謝異常作為切入點，采用分子和細胞生物學等方法系統(tǒng)分析研究髓性白血病糖酵解相關(guān)分子的表達與耐藥形成的關(guān)系，以及在體外調(diào)控糖酵解對化療敏感性的影響并探討其機制，從而為逆轉(zhuǎn)髓性白血病化療耐受的治療提供新思路。
　　 第一部分糖酵解相關(guān)分子表達與髓性白血病化療敏感性的研究
　　 研究目的：
　　 1.探討髓性白血病細胞糖酵解活性與化療耐受的關(guān)系。
　　 2.探討髓性白血病細胞糖酵解相關(guān)分子的表達與化療耐

6、受的關(guān)系。
　　 3.探討髓性白血病細胞線粒體ATP合成酶的表達與化療耐受的關(guān)系。
　　 材料和方法：
　　 1.細胞培養(yǎng):
　　 對阿霉素(ADM)敏感和耐藥AML細胞株(HL-60和HL-60/ADM)，以及對IM敏感和耐藥CML細胞株(K562和K562-R)均采用含10％FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)，置5％CO培養(yǎng)箱、37℃飽和濕度培養(yǎng)。
　　

7、2.臨床標本:
　　 54例患者骨髓標本來自南方醫(yī)院血液科和中山人民醫(yī)院血液科2010年12月至2011年11月間住院的非M3型AML患者，骨髓白血病細胞≥80％。其中初治45例，復發(fā)9例。男31例，女23例，平均年齡41.6±17.8歲。另選取19例健康對照者，男11例，女8例，平均年齡39.2±14.1歲，對照組的年齡、性別構(gòu)成比與AML病例經(jīng)卡方檢驗無明顯差異(p＞0.05)。
　　 3.實驗方法:
　　

8、(1)葡萄糖消耗實驗檢測不同化療敏感性髓性白血病細胞株糖酵解活性。
　　 (2)熒光定量PCR檢測不同化療敏感性髓性白血病細胞（細胞株和AML原代細胞）糖酵解相關(guān)基因(HIF-1α、FBP1、HK-Ⅱ和GLUT1)mRNA的表達。
　　 (3)酶促法檢測不同化療敏感性AML患者血清LDH含量。
　　 (4)流式細胞術(shù)檢測不同化療敏感性AML患者白血病細胞CD147的表達。
　　 (5)免疫印跡(Weste

9、rnBlot)檢測不同化療敏感性髓性白血病細胞（細胞株和AML原代細胞）線粒體ATP合成酶ATP5B蛋白表達。
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件;統(tǒng)計結(jié)果用(x)±s表示;兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較用單向方差分析(one-WayANOVA)，若方差齊性，組間差異采用LSD法做多重比較;若方差不齊采用welch法檢驗，組間差異采用Dunnett'sT3法做多重比

10、較。組間率的比較采用卡方檢驗。以a=0.05為檢驗標準，采用雙側(cè)檢驗。p值≤0.05時，認為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.髓性白血病細胞株糖酵解活性與化療耐受性的關(guān)系
　　 耐藥細胞株HL-60/ADM和K562-R的糖酵解活性均明顯高于相對應(yīng)的化療敏感細胞株HL-60和K562。
　　 2.不同化療敏感性髓性白血病細胞糖酵解相關(guān)基因mRNA的表達
　　 (1)髓性白血病細胞株糖酵解相關(guān)

11、基因mRNA的表達
　　 HIF-1αmRNA和GLUT1mRNA在耐藥白血病細胞株HL-60/ADM和K562-R中的相對表達水平較化療敏感的野生型細胞株HL-60和K562高(p＜0.01、p＜0.05)。而另一糖酵解關(guān)鍵酶HK-ⅡmRNA相對表達水平在HL-60耐藥細胞株中明顯低于野生株(p＜0.01)，在K562耐藥細胞株中顯著高于野生株(p＜0.01)。但糖酵解抑制酶FBP1mRNA相對表達水平在HL-60耐藥細胞株中

12、明顯高于野生株(p＜0.01)，在K562耐藥細胞株中顯著低于野生株(p＜0.01)。
　　 (2)HIF-1αmRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達未緩解(NR)組患者HIF-1αmRNA表達量明顯高于對照組、完全緩解(CR)和部分緩解(PR)組，而在對照組、CR和PR組中，HIF-1αmRNA表達量有逐漸升高趨勢。
　　 (3)FBP1mRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達患者FBP1mRNA表達量個體間差異

13、非常大，經(jīng)F檢驗提示各組間無差異(p＞0.05)。
　　 (4)HK-ⅡmRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達NR組患者HK-ⅡmRNA表達量明顯高于對照組、CR和PR組，而在對照組、CR和PR組中，HK-ⅡmRNA表達量有逐漸升高趨勢。
　　 (5)GLUT1mRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達NR組患者GLUT1mRNA表達量明顯高于對照、CR和PR組，而在對照組、CR和PR組中，GLUT1mRNA表達量有

14、逐漸升高趨勢。
　　 3.不同化療敏感性AML患者血清LDH的表達NR組患者血清LDH含量明顯高于對照、CR和PR組，而在對照組、CR和PR組患者中，血清LDH含量有逐漸升高趨勢。
　　 4.不同化療敏感性AML患者CD147的表達化療NR組AML患者骨髓白血病細胞CD147的表達明顯高于CR和PR組。
　　 5.不同化療敏感性髓性白血病細胞線粒體合成酶ATP5B的表達耐藥細胞株HL-60/ADM和K562-R的

15、ATP5B蛋白表達水平明顯低于相對應(yīng)的化療敏感細胞株;化療NR組AML患者骨髓白血病細胞ATP5b蛋白明顯低于CR組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.化療耐藥髓性白血病細胞株的糖酵解活性均明顯高于相對應(yīng)的化療敏感野生型細胞株。
　　 2.HIF-1αmRNA和GLUT1mRNA在耐藥髓性白血病細胞株中的相對表達水平較化療敏感的野生型細胞株高。
　　 3.化療耐受AML患者骨髓白

16、血病細胞HIF-1α、HK-Ⅱ和GLUT1mRNA表達量明顯高于敏感組。
　　 4.化療耐受AML患者骨髓白血病細胞FBP1mRNA表達量與敏感組無差別。
　　 5.化療耐受AML患者血清LDH含量明顯高于敏感組。
　　 6.化療耐受AML患者骨髓白血病細胞CD147的表達明顯高于敏感組。
　　 7.線粒體合成酶ATP5B蛋白表達水平在耐藥髓性白血病細胞株中明顯低于化療敏感的野生型細胞株;同樣化療耐受AM

17、L患者骨髓白血病細胞ATP5B蛋白表達水平亦明顯低于敏感組。
　　 第二部分抑制糖酵解對髓性白血病化療耐受的影響及機制
　　 研究目的：
　　 1.探討抑制糖酵解對髓性白血病細胞株化療耐受性的影響。
　　 2.探討改變糖酵解活性影響髓性白血病細胞株化療敏感性的可能機制。
　　 材料和方法：
　　 1.細胞培養(yǎng):
　　 對ADM敏感和耐藥AML細胞株(HL-60和HL-60/ADM)

18、，以及對IM敏感和耐
　　 藥CML細胞株(K562和K562-R)均采用含10％FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)，置5％CO2培養(yǎng)箱、37℃飽和濕度培養(yǎng)。
　　 2.實驗方法:
　　 (1)臺盼藍染色計數(shù)法檢測細胞活力
　　 取指數(shù)生長期細胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)，處理組分別加入不同濃度藥物（糖酵解抑制劑、化療藥、糖酵解抑制劑+

19、化療藥），培養(yǎng)3d，每天計數(shù)活細胞數(shù)目（臺盼藍拒染）。采用Weeb系數(shù)檢驗糖酵解抑制劑聯(lián)合化療藥是否具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 (2)MTT法檢測細胞活力
　　 取指數(shù)生長期細胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)，處理組分別加入不同濃度藥物（糖酵解抑制劑、化療藥、糖酵解抑制劑+化療藥），培養(yǎng)3d，MTT實驗檢測細胞活力。采用Weeb系數(shù)檢驗糖酵解抑制劑聯(lián)合化療藥是否具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 (3)葡

20、萄糖消耗實驗檢測不同化療敏感性髓性白血病細胞株糖酵解活性。
　　 將106個不同處理組白血病細胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)置入無血清RPMI1640中，培養(yǎng)4d，收集細胞上清。按照Glucose(HK)Assay試劑盒說明，在波長340nm處觀察其吸光度，并計算溶液中的葡萄糖含量。
　　 (4)AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡
　　 將106個不同處理組白血病細胞(HL-

21、60、HL-60/ADM、K562和K562-R)培養(yǎng)1d后，采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡情況。
　　 (5)RNA干擾HIF1α或GLUT1基因后檢測耐藥AML細胞化療敏感性的變化
　　 首先設(shè)計針對靶基因HIF1α或GLUT1的shRNA序列，通過電轉(zhuǎn)染實驗對耐藥細胞株HL-60/ADM進行轉(zhuǎn)染，再通過熒光定量PCR和WesternBlo檢測RNA干擾效果，從而篩選shRNA靶序列。
　　 將shRN

22、A序列利用酶切、連接等基因重組技術(shù)構(gòu)建到慢病毒載體pLVX-shRNA1上，然后轉(zhuǎn)染Lenti-X293T細胞進行病毒包裝，將包裝好的病毒感染HT-1080細胞進行病毒滴度測定;同時用病毒感染HL-60/ADM細胞后檢測RNA干擾效果。
　　 將包裝好的病毒感染HL-60/ADM細胞，通過嘌呤霉素篩選3次后建立穩(wěn)定表達pLVX-shRNA1-HIF1α和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細胞株。然后，通過MT

23、T法檢測經(jīng)不同濃度組ADM處理后這些細胞株的存活率。
　　 3.統(tǒng)計分析
　　 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件;統(tǒng)計結(jié)果用(x)±s表示;兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較用單向方差分析(one-WayANOVA)，并進行方差齊性檢驗，與對照組比較用Dunnett-t法檢驗。組間率的比較采用卡方檢驗。以a=0.05為檢驗標準，采用雙側(cè)檢驗。p值≤0.05時，認為有顯著性差異。
　　

24、結(jié)果：
　　 1.抑制糖酵解對髓性白血病細胞株增殖的影響
　　 臺盼藍染色法和MTT法結(jié)果顯示，糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA聯(lián)合ADM對耐藥細胞株HL-60/ADM具有顯著協(xié)同作用，而對野生細胞株HL-60不具有協(xié)同作用。同樣，2-DG或3BrPA聯(lián)合IM對耐藥細胞株K562-R具有顯著協(xié)同作用，而對野生細胞株K562不具有協(xié)同作用。
　　 2.抑制糖酵解對不同化療敏感性髓性白病細胞株糖酵解活性的影響

25、　　 糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA單獨或聯(lián)合細胞毒藥物使用均可顯著降低HL-60和K562敏感和耐藥細胞株葡萄糖的消耗，而單獨使用細胞毒藥物，葡萄糖消耗的減少不明顯。
　　 3.抑制糖酵解對不同化療敏感性髓性白血病細胞凋亡的影響
　　 糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA單獨或聯(lián)合化療藥處理HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R細胞24h后，細胞凋亡率無明顯差別;而聯(lián)合處理明顯提高了這些細胞的壞死率。<

26、br>　　 4.siRNA沉默HL60/ADM細胞HIF1α或GLUT1基因表達后化療敏感性改變
　　 構(gòu)建了穩(wěn)定表達pLVX-shRNA1-HIF1α和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細胞株。MTT結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達pLVX-shRNA1-HIF1α的HL-60/ADM細胞對ADM的化療敏感性無明顯改變，而穩(wěn)定表達pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細胞對ADM的化療敏感性明顯提高。<

27、br>　　 結(jié)論：
　　 1.糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA通過抑制葡萄糖消耗可增強ADM對化療耐藥細胞藥敏性;同樣，2-DG或3BrPA聯(lián)合IM對K562-R細胞具有協(xié)同殺傷作用。
　　 2.2-DG或3BrPA對髓性白血病細胞的化療毒性增強作用主要依賴于非凋亡的細胞死亡途徑。
　　 3.RNA干擾沉默GLUT1基因可提高HL-60/ADM細胞對ADM的敏感性，而HIF-1α基因沉默未能明顯提高提高HL-6