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文檔簡介
1、背景:胃癌是危及我國居民生命的最常見惡性腫瘤之一。近年來隨著早診技術(shù)提高和以手術(shù)為主的綜合治療技術(shù)的發(fā)展使得胃癌患者預(yù)后得到很大改善。但是胃癌的五年生存率仍然不足30%。侵襲和轉(zhuǎn)移以及耐藥依然是治療失敗的主要原因。腫瘤干細(xì)胞具有自我分化、自我增殖、耐放化療等特性,被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。目前多項研究表明Hedgehog-Gli1信號通路在多種不同的腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性的維持中具有重要的作用,其中Gli1是該信號通路的節(jié)點(diǎn)基因。為了
2、改善胃癌患者預(yù)后、提高放化療及基因治療的效果,設(shè)計了該實驗對胃癌干樣細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等機(jī)制進(jìn)行深入研究,期待為臨床開發(fā)針對于臨床耐藥、易于轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的治療方法提供一些線索和思路。
目的:研究Gli1在胃癌干樣細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)其與胃癌干樣細(xì)胞的增殖、侵襲、耐藥的關(guān)系,并探討其與其他信號通路的相互調(diào)節(jié),探討以慢病毒載體為基礎(chǔ)的基因治療在胃癌領(lǐng)域發(fā)展的價值。
方法:
1、培養(yǎng)鑒定胃癌干樣細(xì)胞(
3、cancer stem cell-like cancer cells),通過懸浮球培養(yǎng)、增殖實驗、體內(nèi)成瘤實驗,確定其腫瘤干細(xì)胞(cancer stemcells)標(biāo)志物,分離出富集腫瘤干細(xì)胞的胃癌側(cè)群細(xì)胞。
2、構(gòu)建慢病毒干涉載體sh-Gli1-RNA,下調(diào)Gli1在胃癌干樣細(xì)胞中的表達(dá),通過qPCR和Western-blot檢測Gli1表達(dá)的改變,驗證干涉載體下調(diào)細(xì)胞中Gli1表達(dá)的效果。
3、下調(diào)Gli1前后:
4、通過克隆形成實驗、CCK8實驗、Transwell實驗檢測胃癌干樣細(xì)胞中的增殖能力、遷徙能力的影響、化療耐受性的變化;通過流式凋亡檢測分析SMO拮抗劑cyclopamine與sh-Gli1-RNA對胃癌干樣細(xì)胞凋亡的影響有無差距;通過小鼠成瘤實驗檢測下調(diào)Gli1對胃癌干樣細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
4、上調(diào)ZNRF3表達(dá):通過qPCR和Western-blot檢測ZNRF3與Gli1的變化關(guān)系;通過Annexin/PI檢測其對胃
5、癌細(xì)胞及黏膜細(xì)胞增殖凋亡的影響;通過qPCR和Western-blot檢測其與Bcl-2、Ki-67等凋亡、增殖蛋白的相互調(diào)節(jié)關(guān)系;在原代胃癌細(xì)胞中檢測ZNRF3與Gli1表達(dá)。
結(jié)果:
1、培養(yǎng)鑒定胃癌干樣細(xì)胞,懸浮球培養(yǎng)、增殖實驗、體內(nèi)成瘤實驗,確定CD44+CD54+是胃癌干細(xì)胞的標(biāo)志物,CD44+CD54+的胃癌細(xì)胞是富集胃癌干細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞。
2、下調(diào)Gli1在胃癌干樣細(xì)胞中的表達(dá)后,懸浮球?qū)嶒灐?/p>
6、qPCR和Western-blot檢測結(jié)果均顯示Gli1表達(dá)下降,證明轉(zhuǎn)染效率佳。
3、下調(diào)Gli1可以引起以下變化:通過克隆形成率實驗、CCK8實驗結(jié)果、Transwe1l實驗檢測、小鼠成瘤實驗顯示胃癌干樣細(xì)胞的增殖能力、遷徙能力、化療耐藥、體內(nèi)成瘤能力均降低。流式凋亡檢測分析顯示sh-Gli1-RNA比cyclopamine對胃癌干樣細(xì)胞凋亡的降低作用更顯著。
4、調(diào)高ZNRF3表達(dá)后:qPCR和Western檢
7、測發(fā)現(xiàn)Gli1的變化下降;Annexin/PI檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)ZNRF3可增加胃癌細(xì)胞及黏膜細(xì)胞增殖凋亡,對胃癌細(xì)胞影響更為顯著;qPCR和Western檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)ZNRF3可以降低Bcl-2、Ki-67表達(dá);在原代胃癌細(xì)胞中檢測ZNRF3與Gli1表達(dá)負(fù)相關(guān)。
結(jié)論:
1、Gli1參與調(diào)控胃癌干樣細(xì)胞的自我增殖、耐藥、體內(nèi)成瘤。
2、下調(diào)Gli1的表達(dá)可以有效地抑制胃癌干樣細(xì)胞的增殖、侵襲能力、化療耐藥性、
8、動物體內(nèi)成瘤能力。
3、Hedgehog信號通路還能受抑癌基因ZNRF3的調(diào)控,上調(diào)ZNRF3可以下調(diào)Gli1的表達(dá),進(jìn)而增加胃癌干樣細(xì)胞的凋亡。
4、Gli1在胃癌干樣細(xì)胞的增殖、侵襲、耐藥和體內(nèi)成瘤能力方面起到重要的作用。因此,Gli1可以成為治療的靶點(diǎn)。Sh-Gli1-RNA慢病毒載體是一種值得開發(fā)的治療胃癌的手段。
5、ZNRF3可以降低Gli1的表達(dá),我們推測ZNRF3可能通過改變Gli1的表達(dá)進(jìn)
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