Her2-ScFv導(dǎo)向的RNAi對(duì)Her-2陽(yáng)性乳腺癌治療的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文Her2ScFv導(dǎo)向的RNAi對(duì)Her2陽(yáng)性乳腺癌治療的研究姓名：姚燕丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：宋爾衛(wèi)20090605白導(dǎo)向RNAi的能力和基因沉默作用，并觀察其抗腫瘤效應(yīng)。研究方法：構(gòu)建用于表達(dá)F5P融合蛋白的質(zhì)粒后，通過(guò)昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染、表達(dá)、純化和鑒定融合蛋白。隨后用動(dòng)態(tài)光散射和Gelshiftassay方法評(píng)價(jià)F5P融合蛋白與核酸物質(zhì)結(jié)合的能力。在體外用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和共聚焦

2、顯微鏡技術(shù)評(píng)價(jià)F5P融合蛋白能否把熒光標(biāo)記的siRNA輸送到Her2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞；隨后在體內(nèi)用小動(dòng)物成像系統(tǒng)和腫瘤冰凍切片評(píng)價(jià)F5P融合蛋白把熒光標(biāo)記的siRNA輸送到體內(nèi)后在腫瘤區(qū)域的分布。用F5P融合蛋白輸送PLKlsiRNA處理Her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，并用RTPCR、Westernblot和RealtimePCR評(píng)價(jià)靶基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平；接著用3H胸腺嘧啶核苷、MTT、球囊形成能力和多種檢測(cè)凋亡的方法評(píng)價(jià)F5P融合

3、蛋白靶向輸送siRNA治療后對(duì)增殖的抑制和對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用。在體內(nèi)通過(guò)尾靜脈注射F5P融合蛋白和PLKlsiI冰A進(jìn)行靶向治療Her2陽(yáng)性乳腺癌原位移植模型和轉(zhuǎn)移模型，并測(cè)量和繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和生存曲線、腫瘤組織切片免疫組化增殖和凋亡染色以及小動(dòng)物成像系統(tǒng)和RealtimePCR等進(jìn)行療效綜合評(píng)價(jià)。研究結(jié)果：1成功構(gòu)建pACgp67BHer2一ScFvProtamine質(zhì)粒，并經(jīng)過(guò)昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)；檢測(cè)顯示在咪唑濃度為2

4、50mM的條件下洗脫時(shí)所獲得的融合蛋白純度較高。2動(dòng)態(tài)光散射和Gelshiftassay檢測(cè)顯示融合蛋白能夠與核酸物質(zhì)結(jié)合，而且結(jié)合siRNA后顆粒大小沒(méi)有明顯的改變。3用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)顯示F5P融合蛋白能夠把FAMsiRNA輸送到Her2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)。小動(dòng)物成像系統(tǒng)和腫瘤冰凍切片也同樣顯示F5P融合蛋白把FAMsiRNA輸送到Her2陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤。4F5P融合蛋白靶向輸送PLKIsiRNA到Her2陽(yáng)