高糖對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響.pdf

1、背景：糖尿病腎病在西方發(fā)達(dá)國(guó)家已成為終末期腎病(End Stage RenalDisease，ESRD)的首要原因。隨著糖尿病的發(fā)病率逐漸增加，糖尿病腎病在我國(guó)的腎衰竭患者中也逐漸增加，造成了巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，其發(fā)病機(jī)制成為近年來(lái)腎臟病學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與糖尿病腎病發(fā)生密切相關(guān)，蛋白尿是糖尿病腎病中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損害的標(biāo)志之一。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障直接與血液接觸的結(jié)構(gòu)，

2、但內(nèi)皮細(xì)胞在糖尿病腎病中的損傷機(jī)制尚未完全明了，多數(shù)研究提示高糖是誘導(dǎo)因素之一。目前提出了幾種假說(shuō)，如高灌注假說(shuō)、醛糖還原酶假說(shuō)、糖基化終末產(chǎn)物假說(shuō)等。最近研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗體(AngiotensinⅡ receptor blo

3、cker,ARB)可減輕這種損傷和凋亡，提示糖尿病腎病時(shí)可能存在AngⅡ等物質(zhì)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能狀態(tài)受損，在糖尿病腎病進(jìn)展中發(fā)揮作用。既然高糖與AngⅡ均可引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且近年研究在足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)均證實(shí)有腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是否存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)?高糖刺激后會(huì)不會(huì)激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，進(jìn)而引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，加重糖尿病腎病的進(jìn)展?目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。
　　 基

4、于以上假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，目的是探討高糖對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞AngⅡ的影響及其機(jī)制，并分別從基因和蛋白水平檢測(cè)腎素-血管緊張素系統(tǒng)各成分的變化。
　　 目的：觀察高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的原代大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)改變及其機(jī)制，探討其在糖尿病腎病發(fā)病中的作用。
　　 方法：大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在正常糖濃度培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)后同步化，然后分組：正常對(duì)照組、高糖組、高滲對(duì)照組、卡托普利對(duì)照組、高糖+卡托普利

5、組、糜蛋白酶抑制劑對(duì)照組、高糖+糜蛋白酶抑制劑組；卡托普利及糜蛋白酶抑制劑均于高糖刺激前1小時(shí)加入。上述各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞總蛋白，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液與細(xì)胞內(nèi)的AngⅡ水平；Real-time PCR檢測(cè)血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)、腎素(Renin)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)分子表達(dá)水平

6、；Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞血管緊張素Ⅱ1型受體(AngiotensinⅡ type1 receptor blocker,AT1 R)、血管緊張素Ⅱ2型受體(AngiotensinⅡ type2 receptorblocker,AT2R)與血管緊張素原、腎素蛋白表達(dá)水平；激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)AT1R、AT2R、腎素在細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　 結(jié)果：(1)高糖刺激12h，細(xì)胞上清AngⅡ的水平(612.01±4.2

7、4 pg/ml)較正常對(duì)照組(76.23±2.83 pg/ml)明顯升高(P=0.000)，但細(xì)胞內(nèi)AngⅡ的水平(82.37±1.25 pg/ml)較正常對(duì)照(80.31±1.20 pg/ml)升高不明顯(P=0.94)。高糖刺激72h后，細(xì)胞上清液(495.01±56.27 pg/ml)和細(xì)胞內(nèi)(434.10±49.00pg/ml)的AngⅡ水平均分別較正常對(duì)照組(76.23±2.83 pg/ml；80.31±1.20pg/ml)明

8、顯升高(P=0.000；P=0.000)。高糖刺激24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)外的AngⅡ水平均未發(fā)生明顯變化。卡托普利、糜蛋白酶抑制劑可分別抑制細(xì)胞外AngⅡ水平的升高(86％、85％)和細(xì)胞內(nèi)AngⅡ水平的升高(39％、70％)。(2)Real-time PCR顯示高糖可分別引起血管緊張素原mRNA表達(dá)上調(diào)約6.75倍(P＜0.05)、腎素mRNA下調(diào)約89.1％(P＜0.05)，ACEmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。(3)Western bl

9、otting顯示高糖刺激可導(dǎo)致血管緊張素原蛋白表達(dá)上調(diào)、AT1R蛋白表達(dá)下調(diào)，而AT2R、腎素蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，但激光共聚焦間接免疫熒光觀察到AT2R發(fā)生由細(xì)胞核到細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：高糖可激活大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，這種作用可被卡托普利、糜蛋白酶抑制劑部分抑制，說(shuō)明高糖激活大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)至少與兩條產(chǎn)生AngⅡ的途徑有關(guān)(ACE與非ACE途徑)。高糖引起大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)