轉(zhuǎn)錄因子C-EBPα在原發(fā)性腎小球疾病中的研究.pdf

1、終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是各種慢性腎臟病(chronic kidneydisease,CKD)進(jìn)展的最終結(jié)果。在歐美等發(fā)達(dá)國家,ESRD患者數(shù)目以每年5％-8％的速度迅速增長。美國腎臟數(shù)據(jù)登記系統(tǒng)(United States Renal Data System,USRDS)報(bào)告預(yù)計(jì)2015年美國ESRD發(fā)病和患病人數(shù)分別將高達(dá)13.6萬人/年和71.2萬人,與2000年相比分別上升了44％和

2、85％。國外普通人群中CKD患病率10％-16％,我國社區(qū)流調(diào)CKD患病率約9％-12％,上海瑞金醫(yī)院腎臟科2006年開展CKD發(fā)病率調(diào)查顯示在上海城市社區(qū)人群中CKD患病率為11.8％,但知曉率僅8.2％。由于CKD起病隱匿,早期易忽視,約50％為中青年及兒童患者,社會(huì)危害性極大。同時(shí)ESRD患者透析治療費(fèi)用昂貴,消耗了巨大的社會(huì)衛(wèi)生資源。因此,CKD己成為重要的全球公共衛(wèi)生問題。
　　CKD的發(fā)病原因眾多,不同病因?qū)е侣阅I功

3、能衰竭的進(jìn)展速率不同。即使是相同的原發(fā)病,如IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN),膜性腎病(membranousnephropathy,MN),其中部分患者可快速進(jìn)展至ESRD,而另一部分患者病情可能相對(duì)穩(wěn)定。因此,如能篩選出疾病進(jìn)展迅速的高?；颊?并給予積極治療,預(yù)防疾病進(jìn)展到ESRD,有著更為重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前臨床工作中常用病理表現(xiàn)、血壓、蛋白尿和血肌酐等指標(biāo)判斷疾病的預(yù)后,但這些指標(biāo)敏感性和特異性遠(yuǎn)不能令人滿意

4、。所以,應(yīng)用現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù),篩選CKD患者血液和尿液相關(guān)標(biāo)志蛋白以及和疾病進(jìn)展相關(guān)的標(biāo)志物,對(duì)疾病早期診斷、早期治療乃至研究CKD病理生理機(jī)制具有重要價(jià)值。
　　本研究利用蛋白指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同病理分型CKD患者進(jìn)行血液和尿液相關(guān)蛋白標(biāo)記分析,篩選出有意義的生物學(xué)標(biāo)記蛋白,并在臨床患者中進(jìn)行驗(yàn)證,為CKD提供非創(chuàng)傷性診斷平臺(tái)。研究第一部分利用已成功建立的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái),通過iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS技

5、術(shù)對(duì)原發(fā)性腎小球腎炎患者血清及尿液蛋白進(jìn)行標(biāo)記鑒定。通過ProteinPilot軟件分析,質(zhì)譜分析鑒定質(zhì)譜峰(spectra)1956個(gè).篩選差異明顯蛋白97個(gè),通過生物信息學(xué)技術(shù),對(duì)篩選的蛋白修飾位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、功能分類以及蛋白交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析處理后,篩選出靶標(biāo)蛋白之一C/EBPα(CAAT/enhancer binding proteins,C/EBP)。發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腎小球腎炎患者血清中C/EBPα水平較正常對(duì)照組下降,而尿液中

6、C/EBPα水平較正常對(duì)照組上升,應(yīng)用ELISA方法發(fā)現(xiàn)尿液中C/EBPα水平具有疾病差異性(MN組和IgAN組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05)。通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn),原發(fā)性腎小球腎炎患者腎臟組織存在C/EBPα表達(dá)由胞核向胞漿轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。上述結(jié)果提示C/EBPα可能可作為判斷慢性腎臟病或腎臟炎癥損傷的一個(gè)生物標(biāo)志蛋白,并應(yīng)用于指導(dǎo)臨床的診斷和治療。
　　本研究第二部分利用大鼠阿霉素腎病模型模擬人類腎小球疾病,檢測病理情況下腎臟組織、

7、血清和尿液C/EBPα的變化趨勢。其變化趨勢與原發(fā)性腎小球疾病時(shí)C/EBPα在血清和尿液中相似,再次驗(yàn)證了第一部分蛋白組學(xué)的結(jié)果。同時(shí),根據(jù)C/EBP家族特性,推測C/EBPα蛋白與PPARγ在腎臟疾病進(jìn)展中可能存在串話作用,應(yīng)用蛋白印跡法檢測病理情況下C/EBPα蛋白與PPARγ變化的趨勢的相關(guān)性,提示C/EBPα與腎臟纖維化的發(fā)生或腎臟疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。
　　本研究第三部分以腫瘤壞死因子(tumor necrosis fac

8、tor-alpha,TNF-a)及白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)為刺激劑,以人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2細(xì)胞)為研究對(duì)象,通過轉(zhuǎn)染野生型C/EBPα質(zhì)粒進(jìn)一步觀察炎癥反應(yīng)狀態(tài)下C/EBPα蛋白、PPARγ與單核細(xì)胞趨化因子(Monocyte chemotactic protein,MCP-1)及白介素-6(Interleukin-6,IL-6)表達(dá)的變化特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細(xì)胞在

9、相同炎癥因子刺激下,分泌的相關(guān)趨化因子明顯減少,表明細(xì)胞高表達(dá)C/EBPα可提高細(xì)胞的抗炎能力。同時(shí),轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細(xì)胞PPARγ的表達(dá)量明顯升高,在炎癥狀態(tài)下早期下降,后期有所增高,和相關(guān)趨化因子分泌的時(shí)間相匹配。這提示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細(xì)胞可通過上調(diào)PPARγ在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量達(dá)到其抗炎作用的。因此,上調(diào)細(xì)胞中的C/EBPα蛋白可作為抗炎治療的靶點(diǎn)。
　　綜上,本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腎小球