核糖核苷酸還原酶M2亞基在結腸直腸癌及紫外線誘導的DNA損傷修復中的重要作用.pdf

1、目的：
　　 研究核糖核苷酸還原酶M2在結腸直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及紫外線誘導的直腸結腸癌細胞DNA損傷修復中的作用機制。
　　 方法：
　　 (1)應用免疫組化染色技術（Immunohistochemical staining）對組織芯片(Tissue microarray)進行染色，觀察核糖核苷酸還原酶M2（RRM2）在結腸直腸癌組織中的表達;應用逆轉錄聚合酶連反應(PCR)和蛋白質印跡(Westernblo

2、t)技術分別觀察核糖核苷酸還原酶M2在mRNA水平和蛋白水平的表達情況。
　　 (2)培養(yǎng)HCT116，SW480和SW620等七株結腸直腸癌細胞株，細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖，流式細胞儀V-FITC（異硫氰酸熒光素）/腆化丙啶(PI)雙標記法對不同處理的細胞進行細胞周期和凋亡的分析。
　　 (3) Transwell小室實驗評估轉染后結腸直腸癌細胞遷移能力和侵襲能力。
　　 (4)將經過

3、不同處理的細胞置于254nm紫外線燈的照射下，觀察下調/抑制核糖核苷酸還原酶M2表達后細胞對紫外線輻射的敏感度。
　　 (5)短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾并下調RRM2的表達，分別觀察真核生物胞質伴侶素(chaperonin containing TCP1 complex，CCT)ζ-1和Polo-樣激酶1(PLK1)的表達情況。免疫共沉淀( Coimmunoprecipitation，Co-IP)技術觀察CCTζ-1，PLK

4、1和RRM2三個蛋白之間的相互關系。
　　 結果：
　　 (1)結腸直腸癌組織中RRM2的表達明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)，且與浸潤深度(P＜0.05)、低分化程度(P＝0.0051)、TNM分期(P=0.0015)均具相關性;
　　 (2) HCT116細胞中RRM2呈現高表達，下調RRM2表達后，其增殖能力較對照組明顯下降(P＜0.05)
　　 (3)在遷徙實驗中，RRM2干擾組穿膜細胞數為（

5、11±2）個，低于陰性對照組[(29±4)個]和空白對照組[(23±3)個](P＜0.01）。在侵襲試驗中，RRM2干擾組穿膜細胞數為（81±3）個，低于陰性對照組[(289±7)個]和空白對照組[（301±7.2）個](P＜0.01)。
　　 (4)下調核糖核苷酸還原酶M2表達后結腸直腸癌細胞對紫外線輻射的敏感度增強。
　　 (5)短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾并下調RRM2的表達后，真核生物胞質伴侶素ζ-1(CCTζ

6、-1)和Polo-樣激酶1(PLK1)的表達水平也出現降低，提示Plk1，CCTζ-1可能是RRM2的下游蛋白;免疫共沉淀提示CCTζ-1可以與RRM2抗體共沉淀。同時，課題組觀察到抑制PLK1的表達可以降低細胞的增殖能力，并誘導凋亡。下調而CCTζ-1不能誘導凋亡。
　　 (6)干擾并下調PLK1的表達可以降低結腸直腸癌細胞的侵襲能力，而僅沉默CCTζ-1則不能降低結腸直腸癌細胞的侵襲能力。
　　 結論：