鯽魚乙酰膽堿酯酶對有機磷農藥敏感性及有機磷農藥殘留研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶（Acetyl Cholinesterase，AChE）是一種多分子型糖蛋白，存在于生物體內神經(jīng)組織、肝臟、肌肉、紅細胞以及脾臟中，在生物神經(jīng)傳導中起重要作用，其活性受有機磷和氨基甲酸酯類農藥特異性抑制，AChE的活性變化是敏感的農藥毒理學指標，可被應用于農藥的毒性和環(huán)境污染評價的生物標記物。因而關于AChE的研究成為環(huán)境、農藥、毒理領域的研究熱點。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)中對有機磷農藥（Organophosphorus pest

2、icides OPs）較敏感的一類動物，而關于淡水魚類乙酰膽堿酯酶的研究鮮見報道。
　　 本文首次以淡水魚類鯽魚為對象，提取其腦、肝臟、肌肉中的AChE并進行分離純化，對其生化性質進行了研究。進而以六種有機磷農藥為抑制劑，探討和評價了鯽魚AChE對有機磷農藥的敏感性。建立了兩種有機磷農藥敵敵畏和辛硫磷的化學發(fā)光快速分析方法；建立了鯽魚中辛硫磷殘留量的高效液相色譜分析法。研究結論如下：
　　 1．以鯽魚、兔、雞為AChE酶

3、源，測定并比較了三種動物以及同一動物的不同部位的蛋白質含量，AChE酶活及對有機磷農藥敵敵畏的敏感性指標IC50。研究結果為：七種酶源中，鯽魚腦AChE比酶活最高，達105.59μmol/min.g，而其IC50值僅為8.168μg/mL，為所篩選酶源中的最低值。故確定鯽魚為AChE酶源。
　　 2．首次運用正交實驗法探討了鯽魚腦、肝臟、肌肉中AChE的提取條件的優(yōu)化組合。研究結論為：鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶的最佳提取條件

4、為，提取液為pH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液、勻漿比為1：4。在此條件下鯽魚腦、肝臟和肌肉中AChE的比酶活最高，比酶活力值最大。其AChE比酶活分別為149μmol/min.g，13μmol/min．g和262μmol/min.g。
　　 3．運用中心組合實驗和響應面分析法得鯽魚腦、肝、肌肉AChE比酶活測定最佳條件組合為，魚腦酶活測定的最佳條件為保溫時間35min，保溫溫度32℃，pH值7.6。肝臟酶活測定的最佳條件為保溫時間

5、28mm，保溫溫度30℃，pH值7.6。肌肉酶活測定的最佳條件為保溫時間31min，保溫溫度31℃，pH值7.6。
　　 4．鯽魚腦、肝、肌肉AChE的生化性質參數(shù)及對六種有機磷農藥的敏感性評價指標結果如下：
　　 4.1鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液的米氏常數(shù)Km值分別為1.063mmol/L，7.864mmol/L，4.028mmol/L；最大反應速度Vmax值分別為52.91mmol/(L.min)，31.

6、746mmol/(L.min)，135.13mmol/(L.min);測得Km值可知：在有機磷農藥敵敵畏抑制條件下，鯽魚腦部乙酰膽堿酯酶與底物親和力最強，其次是肌肉，肝臟中乙酰膽堿酯酶與底物親和力最弱。
　　 4.2鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液對有機磷農藥敵敵畏的雙分子速率常數(shù)Ki值分別為1.011L/(g.min)，0.472L/(g.min)，0.173L/(g.min)。由測得Ki值可知：對于有機磷農藥敵敵畏的抑

7、制，鯽魚腦部乙酰膽堿酯酶的敏感性最強，其次是肝臟，肌肉中乙酰膽堿酯酶的敏感性最弱。
　　 4.3通過測定鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗酶液對六種有機磷農藥的IC50值，分析比較可得以下結論：
　　 鯽魚腦部AChE粗酶液對六種有機磷農藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞三唑磷＞樂果＞倍硫磷。
　　 鯽魚肝臟AChE粗酶液對六種有機磷農藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞樂果＞倍硫磷＞

8、三唑磷。
　　 鯽魚肌肉AChE粗酶液對六種有機磷農藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞三唑磷＞辛硫磷＞殺螟松＞樂果＞倍硫磷。
　　 4.4六種有機磷農藥和膽堿酯酶強抑制劑毒扁豆堿對乙酰膽堿酯酶的抑制效應比較結果為：
　　 鯽魚各部分AChE對敵敵畏和毒扁豆堿表示出較強的敏感性，抑制曲線隨時間呈良好的上升趨勢，而其中肝臟的酶構成種類復雜，例如有超氧化物歧化酶(SOD)等，干擾較大，使趨勢曲線雜亂。
　　 5

9、．對鯽魚腦和肝臟AChE進行了純化和初步結構表征。結果表明，鯽魚肝臟AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析后純化后，純化倍數(shù)達145倍。
　　 鯽魚腦AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析和Sephadex G-200純化后得到了較純的乙酰膽堿酯酶(AChE)，純化倍數(shù)達214倍。經(jīng)紫外吸收光譜、紅外光譜和圓二色譜分析證明，鯽魚腦AC

10、hE純化最終產(chǎn)物具有蛋白質和酶的相關結構特征。
　　 6．建立了鯽魚AChE為之敏感性高的兩種有機磷農藥敵敵畏和辛硫磷在實際樣品種的化學發(fā)光快速分析方法，方法評價指標為：
　　 6.1.在最佳反應條件下，辛硫磷濃度在1.0×10-8g/mL-1.0×10-6g/mL范圍內時，△I與辛硫磷濃度成良好的線性關系，線性回歸方程為y=121.43x+95232，相關系數(shù)r為0.9979，檢出限為5.4×10-9g/mL;敵敵畏濃

11、度在8.0×10-8g/mL-1.0×10-5g/mL范圍內時，△I與敵敵畏濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為y=2013.7x+13292，相關系數(shù)為r=0.9997，檢出限為6.0×10-8g/mL。
　　 6.2.采用化學發(fā)光法和氣相色譜法檢測實際樣品（小白菜）中辛硫磷含量，結果基本吻合；在實際樣品（大白菜和生菜）中未檢出敵敵畏，向實際樣品中添加己知濃度的敵敵畏做回收率實驗，回收率分別達124％和115%，達到了農藥殘

12、留分析相關要求。
　　 6.3.經(jīng)紫外吸收光譜和熒光光譜驗證，確定兩種有機磷農藥的化學發(fā)光反應機理為，魯米諾溶液的最大發(fā)射波長在λmax=420nm處，發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。向魯米諾中加入H2O2后并沒有新的發(fā)光物質生成，發(fā)光體仍然是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。加入辛硫磷和敵敵畏后體系的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生改變，說明發(fā)光體仍舊是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。
　　 7．建立了鯽魚體內辛硫磷殘