HIF-1a、MMP-9、TGF-β1在大鼠肝纖維化組織中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的：觀察缺氧誘導(dǎo)因子－1aLhypoxiainduciblefactor-1a，HIF-1a)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)在大鼠肝纖維化組織中的表達(dá)情況以及TGF-β1疫苗對肝纖維化大鼠肝組織HIF-1a、MMP-9、TGF-β1表達(dá)的影響，分析HIF-1a、MMP-9、TGF-β1與肝

2、纖維化的關(guān)系。 方法：1.動物分組與喂養(yǎng)：健康雄性Sprague-Dawley系大鼠30只，體重80-100g，隨機(jī)分為3組：A組(對照組10只)，B組(肝纖維化模型組10只)，C組(TGF-β1疫苗治療組10只)。所有大鼠均在室溫恒定(20-25℃)及燈光晝夜節(jié)律控制(8:00-22:00)下普通喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，實(shí)驗前12小時開始禁食。2.肝纖維化動物模型的建立：肝纖維化模型組以0.5％的二甲基亞硝胺(DMN)按0.2m

3、l/100g的劑量腹腔內(nèi)注射，每周前3天每天1次，連續(xù)4周；TGF-β1疫苗(之前在本實(shí)驗室合成)治療組在注射二甲基亞硝胺的基礎(chǔ)上于第一周第一天在背部皮下注射疫苗150μg，注射前疫苗用弗氏完全佐劑(FCA)充分混勻乳化，第三周第一天疫苗用弗氏不完全佐劑(FIA)充分混勻乳化后每只老鼠背部皮下注射疫苗150μg；3.取材與切片：實(shí)驗第6周末處死各組大鼠，先用10％水合氯醛0.35ml/kg麻醉，剖腹經(jīng)下腔靜脈采血，取出肝組織立即用中性福

4、爾馬林固定12h，之后脫水透明石蠟包埋。4.免疫組織化學(xué)染色：采用S-P免疫組織化學(xué)方法染色組織切片，每次染色時用試劑公司提供的TGF-β1、HIF-1a、MMP-9陽性片作陽性對照，PBS代替第一抗體作為陰性對照。TGF-β1、HIF-1a、MMP-9免疫組化結(jié)果均使用美國IPP5.0(ImagePro-plus5.0)專業(yè)圖象分析軟件測定平均光密度值，用背景的吸光度值減去陽性部位的吸光度值即為陽性部位的光密度值。5.HE染色、Mas

5、son染色與組織學(xué)觀察：切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色及Masson三色染色后普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)的變化。6.肝功能及HA、LN的檢測：經(jīng)下腔靜脈所采的血標(biāo)本，全自動生化分析儀檢測ALT、AST、Alb，放免法檢測HA、LN。 結(jié)果：1.動物用DMN造模后毛色灰暗，精神萎靡，進(jìn)食進(jìn)水減少，易受驚，體重增長緩慢。血清ALT、AST明顯升高，白蛋白明顯下降。模型組肝病理學(xué)表現(xiàn)為正常小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失，由匯管區(qū)和中央靜脈伸出粗大膠原

6、纖維條索分割、包繞肝小葉，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞濁腫明顯，纖維隔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等浸潤，這表明肝纖維化模型成功建立。與模型組相比，TGF-β1疫苗治療組肝細(xì)胞壞死、纖維組織增生減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，纖維條索疏松變窄，肝細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn)，肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤減少。TGF-β1疫苗治療組ALT、AST、HA及LN水平較模型組明顯減低，白蛋白明顯升高。2.正常對照組大鼠肝組織中TGF-β1、HIF-1a、MMP-9表達(dá)水平較低，明顯

7、低于肝纖維化模型組(P＜0.01)。3.肝纖維化模型組HIF-1a、MMP-9、TGF-β1的表達(dá)明顯增高，經(jīng)TGF-β1疫苗治療后HIF-1a、MMP-9、TGF-β1表達(dá)明顯下降，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：1.TGF-β1疫苗能改善肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)，血清肝功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)。2.免疫組織化學(xué)檢測顯示肝纖維化大鼠肝組織HIF-1a、MMP-9、TGF-β1表達(dá)顯著增加，且與肝纖維化程度呈正相