ABCG1基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)研究及ABCG1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,CAD)是目前我國(guó)最常見(jiàn)、最重要的引起死亡和致殘的疾病之一。許多研究證實(shí)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP binding cassettetransporter)家族的成員ABCA1、ABCG1介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和氧化固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至乏脂或無(wú)脂的HDL前體載脂蛋白AI(ApoA1)以及成熟HDL。ABCG1在介導(dǎo)膽固醇外流至HDL的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。最近研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,ABCG1參與了巨噬

2、細(xì)胞的凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂,這說(shuō)明ABCG1在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中扮演著重要角色。但總的來(lái)說(shuō),ABCG在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用還很不明確。有研究發(fā)現(xiàn)ABCG1啟動(dòng)子-257T>G多態(tài)性與CAD嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究旨在探討ABCG1啟動(dòng)子區(qū)和3’非編碼區(qū)(3’-UTR)的四個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)-768G>A(rs2234714)、-530A>G(rs2234715)、-367G>A(rs57137919)2424A>G(

3、rs1044317)多態(tài)性與中國(guó)患者脂代謝異常及冠心病發(fā)病的相關(guān)性,闡明冠心病患者巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 1.研究中國(guó)漢族人群冠心病患者和正常對(duì)照人群中ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)(-768G>A、-530A>G、-367G>A)和3’-UTR(2424A>G)SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的差異,探索其與冠心病發(fā)病的相關(guān)性。
　　 2.根據(jù)遺傳學(xué)分析結(jié)果,選擇-768G>A和-

4、367G>A兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建野生型和突變型螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒,比較野生型與突變型報(bào)告質(zhì)粒對(duì)ABCG1基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 3.比較不同基因型-367AA/AG/GG冠心病患者外周血原代單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞ABCG1的表達(dá)情況。
　　 研究方法:
　　 1.收集1013例健康受試者和1021名CAD患者(其中心肌梗死患者672例)的靜脈血,提取基因組DNA,應(yīng)用基因測(cè)序和聚合酶鏈反應(yīng)--連接酶檢測(cè)反應(yīng)(PCR-L

5、DR)方法檢測(cè)ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)和3’-UTR的四個(gè)SNP位點(diǎn)-768G>A(rs2234714)、-530A>G(rs2234715)、-367G>A(rs57137919)和2424A>G(rs1044317)基因型,觀察健康對(duì)照組、冠心病組和心肌梗死組這些位點(diǎn)基因型頻率及其與血脂、CAD或心肌梗死發(fā)病的相關(guān)性；
　　 2.根據(jù)病例對(duì)照研究的結(jié)果,選擇-768G>A和-367G>A兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建野生型和突變型螢光素酶報(bào)告質(zhì)

6、粒,體外培養(yǎng)THP—1、RAW264.7、293T細(xì)胞及人外周血單核巨噬細(xì)胞,應(yīng)用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)野生型與突變型報(bào)告螢光素酶質(zhì)粒(pGL3-hasic/P—GG、pGL3-hasic/P—GA、pGL3-basic/P—AG與pGL3-basic/P-AA)的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 3.體外培養(yǎng)不同基因型(-367AA/AG/GG)CAD患者外周血單核巨噬細(xì)胞ABCG1蛋白表達(dá)情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法:連續(xù)變量符合正態(tài)

7、分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的,以中位數(shù)(25百分位-75百分位)表示,采用Mann—whitney U檢驗(yàn)。分類變量基因型/等位基因頻率和Hardy—Weinberg平衡檢驗(yàn)采用chi—squared檢驗(yàn)或者Fisher’s精確檢驗(yàn)；校正年齡、性別、高血壓、2型糖尿病、吸煙、HDL-C和TG潛在混雜因素后,采用多因素logistic回歸分析,計(jì)算調(diào)整后的OR值和95％可信區(qū)間。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS

8、13.0軟件分析,p<0.05(two—tailed)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所選SNPs的配對(duì)連鎖不平衡檢驗(yàn)采用SHEsis軟件計(jì)算D’值和r2值,采用PHASE軟件(version2.1)計(jì)算單體型頻率?；仡櫺越y(tǒng)計(jì)學(xué)效力使用Epi InfoTM軟件(version3.5.1)計(jì)算。病例組和對(duì)照組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異OR小于1.45,p<0.05時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)效力大于8096。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.本對(duì)研究四個(gè)SNP位點(diǎn)均符合

9、Hardy—weinberg平衡。
　　 2.ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)rs57137919多態(tài)位點(diǎn)劣性基因型AA與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降顯著相關(guān)(OR=0.77,95％CI0.60—0.97,p=0.026)。而冠心病或心梗組rs57137919位點(diǎn)劣性等位基因A的頻率顯著低于對(duì)照組(p=0.006或p=0.004)。logistic回歸分析顯示,在顯性模型中,A等位基因的攜帶者(AG+AA)冠心病或心梗發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于GG純合子(C

10、AD組:校正后OR=0.73,p=0.033；心梗組:校正后OR=0.65,p=0.014)。rs57137919位點(diǎn)還與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)。與單支病變組相比,多支病變組等位基因A冠心病風(fēng)險(xiǎn)顯著下降(校正后的OR=0.40,p=0.005)。在THP-1、RAW264.7、HEK293T及人外周血單核巨噬細(xì)胞中,螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒試驗(yàn)驗(yàn)證了ABCG1啟動(dòng)子區(qū)-367G>A,ABCG1基因轉(zhuǎn)錄活性下降(P<0.05)。-367從基因型CA

11、D患者外周血單核-巨噬細(xì)胞ABCG1蛋白表達(dá)水平顯著低于-367GG基因型患者(p<0.001)。
　　 3.冠心病組或心梗組rs2234714位點(diǎn)劣性等位基因A的頻率顯著低于對(duì)照組(p=0.05或p=0.0046),在隱性模型中rs2234714位點(diǎn)與冠心病或心梗發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降相關(guān)(CAD組校正后OR=0.64,p=0.015；心梗組校正后OR=0.49,p=0.001)。但在螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒試驗(yàn)ABCG1啟動(dòng)子區(qū)-768G>A

12、,ABCG1基因轉(zhuǎn)錄活性未見(jiàn)明顯下降(P>0.05).
　　 4.其他兩個(gè)位點(diǎn)rs2234715 and rs1044317的等位基因頻率或基因型分布在冠心病患者和健康受試者中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.在未服用降脂藥的受試者中,rs57137919和rs2234714多態(tài)位點(diǎn)與血漿脂質(zhì)水平無(wú)顯著相關(guān)。
　　 6.單體型A-A-A-A(rs2234714-rs2234715-rs57137919-rs1044317