UV誘導(dǎo)HLEC凋亡的細(xì)胞及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 用不同劑量紫外線(xiàn)(Ultraviolet，UV)照射體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cell，HLEC)，通過(guò)對(duì)HLEC凋亡、凋亡調(diào)控基因(Bax、Bcl-2)、細(xì)胞周期及ALDH1蛋白表達(dá)變化的觀察，探討紫外線(xiàn)誘導(dǎo)HLEC凋亡的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的HLEC細(xì)胞株為研究模型，采用同一紫外線(xiàn)光源(UVA照度為0.29mw

2、/cm2，UVB照度為0.09mw/cm2)，對(duì)HLEC進(jìn)行照射。按UV照射時(shí)間將HLEC分為0min、5min、10min、15min及30min組，UV照射后HLEC放回二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后再進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。
　　 1.UV誘導(dǎo)HLEC凋亡的檢測(cè)：采用Hoechst33342染色、瓊脂糖凝膠電泳對(duì)HLEC凋亡進(jìn)行定性檢測(cè)；AO-EB染色及Annexin-Ⅴ+PI雙染流式細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)HLEC凋亡進(jìn)行定量檢測(cè)，并分析UV

3、照射劑量與凋亡率間的關(guān)系。
　　 2.UV照射誘導(dǎo)HLEC凋亡基因的表達(dá)及細(xì)胞周期的變化：用原位雜交的方法檢測(cè)各組Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　 3.UV照射對(duì)HLEC內(nèi)ALDH1蛋白表達(dá)的影響：用免疫組化的方法觀察ALDH1在對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)，用Western Blot對(duì)其蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 1.UV照射與HLEC凋亡：Hoechst33

4、342染色及AO-EB染色UV處理后各實(shí)驗(yàn)組HLEC均有凋亡特征性形態(tài)改變，如細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核致密濃染或呈碎塊狀形成凋亡小體等。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)除5min組外其余各組都出現(xiàn)DNA ladder，上述三種方法定性證實(shí)UV可誘導(dǎo)HLEC凋亡。AO-EB染色法檢測(cè)HLEC凋亡率在0min、5min、10min、15min、30min組分別為1.82±0.53％、13.15±2.32％、17.58±1.62％、31.16±3.03％、29

5、.25±2.53％(F=146.10，P<0.05)。Annexin-V+PI雙染流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)以上各組凋亡率分別為1.98±0.84％、11.90±3.21％、16.15±3.05％、33.93±3.74％、22.72±6.05％(F=34.16，P<0.05)。兩種方法定性分析均表明隨UV照射時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率增加。
　　 2.UV照射與Bax上調(diào)和Bcl-2下調(diào)：隨UV照射時(shí)間延長(zhǎng)，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸降低，而B(niǎo)ax陽(yáng)

6、性細(xì)胞率逐漸增加。經(jīng)配對(duì)資料T檢驗(yàn)，組與組間差異有顯著性(P<0.05)。HLEC凋亡率與Bcl-2/Bax比率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.874，P<0.05)。
　　 UV照射與HLEC細(xì)胞周期阻滯：各實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞與0min組比較差異有顯著性(P<0.05)，但各實(shí)驗(yàn)組間差別無(wú)顯著性(P>0.05)；經(jīng)單因素方差分析，S期細(xì)胞隨UV照射時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少(F=40.34，P<0.05)。
　　 3.UV照射與ALDH1

7、：ALDH1免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞率在0min、5min、10min、15min及30min組分別為39.23±5.34％、30.57±4.45％、17.91±4.28％、10.25±3.01％、3.83±0.83％，各組陽(yáng)性細(xì)胞率的兩兩比較除0min組與5min組間差異無(wú)顯著性外(P>0.05)，其余各組間兩兩比較差異均有顯著意義(P<0.05)；ALDH1免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞率隨著UV照射時(shí)間延長(zhǎng)而降低(F=68.827，P<0.05