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文檔簡介
1、目的:
川楝素是從我國傳統(tǒng)中藥楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物,具有廣泛的藥理作用。近幾年來研究證明,川楝素在體外可明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,但其機制僅有初步探討。本論文通過體外細(xì)胞培養(yǎng),體內(nèi)建立荷瘤小鼠模型,全面系統(tǒng)地研究川楝素對實體腫瘤肝癌的抗腫瘤作用,并進一步探討川楝素的作用機制及毒副作用。同時,考慮到在治療方法上血液系統(tǒng)惡性腫瘤有別與實體癌,因此,以人慢性髓系白血病K562細(xì)胞為研究對象,從增
2、殖抑制、分化、凋亡三方面對川楝素藥理作用及其機制進行初步探討。
方法:
1.以人肝癌SMMC-7721(P53+)、Hep3B(P53-)細(xì)胞為實驗對象,從以下幾個方面研究川楝素在體外對人肝癌細(xì)胞生長的抑制作用及機制:細(xì)胞計數(shù)法和MTT法檢測川楝素對SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞和正常肝細(xì)胞IAR-20、LO2生長曲線的影響并計算增殖抑制率;觀察SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;Annexin
3、V法檢測早期凋亡率;比色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達變化。
2.建立H22荷瘤小鼠模型,從以下幾個方面觀察川楝素在體內(nèi)對小鼠腫瘤生長的抑制作用及機制:量取腫瘤體積,觀察腫瘤的生長曲線;剝瘤后稱重計算小鼠的腫瘤抑制率;腫瘤組織行病理形態(tài)學(xué)及HE染色觀察;透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變;觀察川楝素對荷瘤小鼠心、肝、脾、腎、胸腺、睪丸組織的影響;免疫組化方
4、法檢測腫瘤組織內(nèi)Bcl-2、Bax和Fas蛋白的表達。
3.以人慢性髓系白血病細(xì)胞K562(P53-)為研究對象,從以下幾個方面研究川楝素在體外對K562細(xì)胞增殖、分化、凋亡作用的影響及其機制:MTT法檢測川楝素對K562細(xì)胞和正常人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)增殖的影響;觀察K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)的改變;AnnexinV法檢測早期凋亡率;DNA ladder分析;聯(lián)苯胺和POX染色法觀察紅系和粒系分化情況;比
5、色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達。
結(jié)果:
1.肝癌細(xì)胞系體外實驗中,0.5μmol/L川楝素可明顯抑制肝癌SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞增殖,且抑制作用呈時間和劑量依賴性,而對正常肝細(xì)胞IAR-20、LO2增殖影響較小;川楝素處理后SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞黏附力降低,部分細(xì)胞皺縮變圓;流式細(xì)胞術(shù)檢測到0.5μmol/
6、L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞72h的凋亡率分別為21.55%、13.35%,經(jīng)caspase抑制劑z-VAD-fmk處理后,細(xì)胞凋亡率降低,TSN+z-VAD-fmk組與TSN組比較有顯著性差異(P<0.05);川楝素處理SMMC-7721細(xì)胞后,Caspase-3、8、9活性均增高,Bcl-2表達減弱,Bax和Fas表達較對照組增強;川楝素處理Hep3B細(xì)胞,Caspase-3、Caspase-9活性增高,Caspa
7、se-8活性無明顯變化,Bcl-2表達減弱,Bax表達增強,而Fas表達無明顯變化。
2.動物實驗顯示,川楝素可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,川楝素低劑量組(0.173mg/kg)、高劑量組(0.69mg/kg)的抑瘤率分別為66.23%、87.01%(P<0.05);腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察可見凋亡小體;HE染色顯示小鼠心、肝、脾、腎、睪丸臟器形態(tài)正常,而胸腺組織可見胸腺小葉的數(shù)量及面積減少甚至消失;免疫組化證實,小鼠
8、腫瘤組織內(nèi)Bcl-2蛋白表達下調(diào),Bax、Fas蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。
3.人慢性髓系白血病細(xì)胞體外實驗中,川楝素對K562細(xì)胞有明顯增殖抑制作用,呈時間和濃度依賴性,而對PBMC幾乎無影響;普通光鏡可見K562細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;超微結(jié)構(gòu)顯示凋亡細(xì)胞和凋亡小體;10,30,50 nmol/L川楝素處理K562細(xì)胞72 h后的早期凋亡率分別為9.66%,26.06%,52.70%(P<0.01);瓊脂糖凝膠電
9、泳可見典型“梯狀”條帶;聯(lián)苯胺和POX染色結(jié)果陰性;激活K562細(xì)胞Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性;凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl表達降低,Bax,F(xiàn)as表達增強(P<0.05)。
結(jié)論:
1.體內(nèi)體外實驗均表明:川楝素對肝癌細(xì)胞有較強的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用,涉及線粒體途徑的參與。
2.體外實驗表明:川楝素對人慢性髓系白血病K562細(xì)胞具有抑制增殖,誘導(dǎo)凋亡的藥理效應(yīng)
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