川楝素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機制.pdf

1、目的：
　　 川楝素是從我國傳統(tǒng)中藥楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的藥理作用。近幾年來研究證明，川楝素在體外可明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但其機制僅有初步探討。本論文通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，體內(nèi)建立荷瘤小鼠模型，全面系統(tǒng)地研究川楝素對實體腫瘤肝癌的抗腫瘤作用，并進一步探討川楝素的作用機制及毒副作用。同時，考慮到在治療方法上血液系統(tǒng)惡性腫瘤有別與實體癌，因此，以人慢性髓系白血病K562細(xì)胞為研究對象，從增

2、殖抑制、分化、凋亡三方面對川楝素藥理作用及其機制進行初步探討。
　　 方法：
　　 1.以人肝癌SMMC-7721（P53+）、Hep3B（P53-）細(xì)胞為實驗對象，從以下幾個方面研究川楝素在體外對人肝癌細(xì)胞生長的抑制作用及機制：細(xì)胞計數(shù)法和MTT法檢測川楝素對SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞和正常肝細(xì)胞IAR-20、LO2生長曲線的影響并計算增殖抑制率；觀察SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；Annexin

3、V法檢測早期凋亡率；比色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達變化。
　　 2.建立H22荷瘤小鼠模型，從以下幾個方面觀察川楝素在體內(nèi)對小鼠腫瘤生長的抑制作用及機制：量取腫瘤體積，觀察腫瘤的生長曲線；剝瘤后稱重計算小鼠的腫瘤抑制率；腫瘤組織行病理形態(tài)學(xué)及HE染色觀察；透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變；觀察川楝素對荷瘤小鼠心、肝、脾、腎、胸腺、睪丸組織的影響；免疫組化方

4、法檢測腫瘤組織內(nèi)Bcl-2、Bax和Fas蛋白的表達。
　　 3.以人慢性髓系白血病細(xì)胞K562（P53-）為研究對象，從以下幾個方面研究川楝素在體外對K562細(xì)胞增殖、分化、凋亡作用的影響及其機制：MTT法檢測川楝素對K562細(xì)胞和正常人外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）增殖的影響；觀察K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)的改變；AnnexinV法檢測早期凋亡率；DNA ladder分析；聯(lián)苯胺和POX染色法觀察紅系和粒系分化情況；比

5、色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.肝癌細(xì)胞系體外實驗中，0.5μmol/L川楝素可明顯抑制肝癌SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞增殖，且抑制作用呈時間和劑量依賴性，而對正常肝細(xì)胞IAR-20、LO2增殖影響較小；川楝素處理后SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞黏附力降低，部分細(xì)胞皺縮變圓；流式細(xì)胞術(shù)檢測到0.5μmol/

6、L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞72h的凋亡率分別為21.55％、13.35％，經(jīng)caspase抑制劑z-VAD-fmk處理后，細(xì)胞凋亡率降低，TSN+z-VAD-fmk組與TSN組比較有顯著性差異（P<0.05）；川楝素處理SMMC-7721細(xì)胞后，Caspase-3、8、9活性均增高，Bcl-2表達減弱，Bax和Fas表達較對照組增強；川楝素處理Hep3B細(xì)胞，Caspase-3、Caspase-9活性增高，Caspa

7、se-8活性無明顯變化，Bcl-2表達減弱，Bax表達增強，而Fas表達無明顯變化。
　　 2.動物實驗顯示，川楝素可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，川楝素低劑量組（0.173mg/kg）、高劑量組（0.69mg/kg）的抑瘤率分別為66.23％、87.01％（P<0.05）；腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察可見凋亡小體；HE染色顯示小鼠心、肝、脾、腎、睪丸臟器形態(tài)正常，而胸腺組織可見胸腺小葉的數(shù)量及面積減少甚至消失；免疫組化證實，小鼠

8、腫瘤組織內(nèi)Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax、Fas蛋白表達上調(diào)（P<0.05）。
　　 3.人慢性髓系白血病細(xì)胞體外實驗中，川楝素對K562細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，呈時間和濃度依賴性，而對PBMC幾乎無影響；普通光鏡可見K562細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；超微結(jié)構(gòu)顯示凋亡細(xì)胞和凋亡小體；10，30，50 nmol/L川楝素處理K562細(xì)胞72 h后的早期凋亡率分別為9.66％，26.06％，52.70％（P<0.01）；瓊脂糖凝膠電

9、泳可見典型“梯狀”條帶；聯(lián)苯胺和POX染色結(jié)果陰性；激活K562細(xì)胞Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9活性；凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl表達降低，Bax，F(xiàn)as表達增強（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.體內(nèi)體外實驗均表明：川楝素對肝癌細(xì)胞有較強的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，涉及線粒體途徑的參與。
　　 2.體外實驗表明：川楝素對人慢性髓系白血病K562細(xì)胞具有抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的藥理效應(yīng)