轉染CD19-CAR的人原代T淋巴細胞的體外抗白血病作用研究.pdf

1、研究目的:隨著基因重組技術日益進步，細胞免疫治療被認為是新世紀腫瘤治療中最有前景的一種治療方式，其中嵌合抗原受體(CAR)因免除了MHC限制性等優(yōu)勢更被寄予厚望。本課題以MigR1質粒為表達載體，構建包括CD19單抗的單鏈可變區(qū)片段、CD28共刺激分子、T細胞受體-ζ鏈的二代靶向CD19 CAR結構(MigR1-CD19-CAR)。同時建立高表達CD19基因的CD19-K562穩(wěn)定轉染細胞株及其穩(wěn)定成瘤NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型

2、。進一步優(yōu)化MigR1-CD19-CAR逆轉錄病毒對人T淋巴細胞(CAR-T)的轉染效率，并以CD19-K562為靶細胞，對CAR-T細胞體外抗白血病作用進行初步研究。
　　研究方法:合成CD19單抗的單鏈可變區(qū)片段、CD28共刺激分子、T細胞受體-ζ鏈的目的基因序列。上述目的基因經(jīng)電泳后行膠回收，利用酶切及連接反應將其構入MigR1質粒，轉化DH5α感受態(tài)細胞，菌落挑取陽性克隆后經(jīng)測序驗證序列準確性。同上方法以擴增后CD19基因

3、片段構建MigR1-CD19重組質粒并測序驗證。將構建的MigR1-CD19重組質粒轉入Plat-A包裝細胞，收集病毒上清重復轉染K562細胞系，采用流式細胞儀檢測CD19基因表達情況后體外反復傳代獲得穩(wěn)轉株，并以細胞計數(shù)、AnnexinⅤ/PI雙重染色法分別檢測其細胞增殖與凋亡特性。應用穩(wěn)轉株皮下接種NOD-SCID小鼠經(jīng)體內、體外傳代后建立移植瘤亞系CD19-K562-a并建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型。利用RT-PCR、瑞

4、氏染色、免疫組化等驗證CD19-K562-a細胞性質。將構建的MigR1-CD19-CAR轉入plat-A包裝細胞，收集病毒上清離心轉染經(jīng)CD3/CD28磁珠及rhIL-2(重組人白介素-2)活化擴增后的人原代T淋巴細胞及K562細胞系，流式細胞儀檢測轉染效率，RT-PCR檢測CD19-CAR目的基因轉錄。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測轉染后CAR-T細胞與靶細胞(CD19-K562)共培養(yǎng)后干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（

5、TNF-α）釋放量。
　　結果:
　　1.測序驗證二代MigR1-CD19-CAR及MigR1-CD19重組質粒分別與目的基因序列（僅MigR1-CD19一處堿基突變，但為無義突變）一致。
　　2.應用MigR1-CD19重組載體經(jīng)Plat-A包裝細胞高效產毒，病毒滴度為(4.33-7.02)×107CFU/ml，離心轉染法重復轉染K562細胞并體外反復傳代后流式細胞儀檢測CD19陽性率為(99.80±0.17)％，獲

6、得穩(wěn)轉株，RT-PCR檢測其CD19基因相對轉錄水平與轉染空載K562、未轉染K562細胞存在明顯差異，而細胞增殖、凋亡未受轉染及傳代過程影響。
　　3.穩(wěn)轉株經(jīng)皮下接種NOD-SCID小鼠，瘤體制成細胞懸液后體外結合體內傳代后建立移植瘤亞系CD19-K562-a，其CD19陽性率為(99.78±0.04)％，且CD19基因與K562細胞原有bcr-abl(210)基因均高效轉錄，瑞氏染色見CD19-K562-a、CD19-K56

7、2、未轉染K562細胞均呈現(xiàn)未分化階段細胞形態(tài)。CD19-K562-a皮下接種NOD-SCID小鼠建立移植瘤模型后行瘤體免疫組化，證實CD19-K562-a瘤體組CD19基因表達強陽性。
　　4.MigR1-CD19-CAR重組載體轉入Plat-A包裝細胞后病毒滴度5.43-7.34×107CFU/ml，分離健康供者及化療后緩解的B系血液系統(tǒng)腫瘤患者的外周血單個核細胞，經(jīng)CD3/CD28磁珠聯(lián)合rhIL-2活化擴增后，T淋巴細胞比

8、例可高達(96.1±4.8)％。
　　5.相同轉染條件（32℃、1800 r/min、離心半徑18.76cm、病毒滴度一定）時，K562細胞系轉染效率高于T淋巴細胞(80.05±4.35)％VS(25.1±5.77)％。對活化擴增后的人原代T淋巴細胞，上述轉染條件下，離心轉染120min的轉染效率為(54.5±14.62)％，相較未離心組(26.6±6.15)％、離心30min組(25.1±5.77)％、離心60min組(30.8

9、±5.54)％均明顯提高，后三組無統(tǒng)計學差異;根據(jù)個體T淋巴細胞體外活化擴增倍數(shù)選擇合適的轉染時機從而提高轉染效率，健康供者轉染效率最高達(68.7±0.6)％，B系惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者（化療后緩解）轉染效率最高達(59.8±0.5)％。
　　6.RT-PCR檢測證實CD19-CAR目的基因在CAR-T細胞中高效特異性轉錄。針對scFv片段、跨scFv末端酶切位點至CD28片段、跨CD28末端酶切位點至TCR片段的3組引物，三組片

10、段相對轉錄水平分別為(2057±549)％、(3737±1101)％、(1001±110)％，對各自陰性對照存在顯著統(tǒng)計學差異（P值均小于0.01）。
　　7.CD19-CAR-T細胞與CD19-K562細胞共培養(yǎng)組IFN-γ(13229.93±1542.99)pg/ml、TNF-α(4466.72±210.77) pg/ml釋放量均增加，與陰性對照組統(tǒng)計學差異均顯著。
　　結論:
　　1.MigR1-CD19-CAR

11、及MigR1-CD19重組載體均構建成功。
　　2.成功建立CD19陽性率高達(99.80±0.17)％的CD19-K562穩(wěn)定轉染細胞株。
　　3.采用體外結合體內傳代建立穩(wěn)定成瘤的NOD-SCID小鼠移植瘤亞系CD19-K562-a并成功建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型。
　　4.轉染條件為32℃、1800 r/min、離心半徑18.76cm時，通過離心轉染120min及根據(jù)體外活化擴增的人原代T淋巴細胞擴增