人CD11clowCD45RBhigh調(diào)節(jié)性DC的培養(yǎng)及鑒定和人源化CML小鼠模型的建立.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)正常人骨髓來(lái)源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞(DCregs)并從其細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力等方面對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　方法：1.分離正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，分別接種到含有不同的細(xì)胞因子的1640培養(yǎng)基中，接種密度為3×106/瓶，培養(yǎng)不同種類(lèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)，并分別用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀(guān)察比較不同組別DCs的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其免疫表型以及DCs的吞

2、噬能力，在單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3d、4d、Sd后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同DCs刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖能力。2.實(shí)驗(yàn)分組如下：①A組：DCregs組，含GM-CSF20 ng/mL，IL-1020 ng/mL，TGF-β120 ng/mL的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，并用脂多糖(LPS)刺激24 h使其成熟。②B組：未成熟DCs(imDCs)組，用含GM-CSF20 ng/mL，IL-410 ng/mL1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d；③C組：成熟

3、DCs(mDCs)組，用含GM-CSF20 ng/mL，IL-410 ng/mL的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，予LPS刺激24 h，使其成熟。
　　結(jié)果：1.正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長(zhǎng)，僅見(jiàn)少量懸浮細(xì)胞，約4d左右出現(xiàn)半黏附細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)逐漸增多、變大，5d時(shí)細(xì)胞表面出現(xiàn)長(zhǎng)短不一毛刺樣突起；培養(yǎng)8d的DCs電鏡下可看到密集的樹(shù)突分布在細(xì)胞周?chē)?.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：DCregs組和imDCs組HLA-DR和CD8

4、0、CD86分子低表達(dá)，mDCs組高表達(dá)HLA-DR、CD80、CD86分子，imDCs組經(jīng)LPS刺激后CD80、CD86及HLA-DR表達(dá)均上調(diào)，DCregs組經(jīng)LPS刺激后CD80、CD86及HLA-DR表達(dá)無(wú)明顯變化，DCregs組與imDCs組、mDCs組相比高表達(dá)CD45RB，低表達(dá)CD11c。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs的吞噬FITC-Dextran能力顯示，DCregs組、imDCs組的平均熒光強(qiáng)度明顯高于mDCs組，差異有統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而DCregs組與imDCs組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，DCregs組、imDCs組增殖率明顯低于mDCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而DCregs組增殖率最低(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.入骨髓源單個(gè)核細(xì)胞在聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF、IL-10和TGF-β1培養(yǎng)8d后獲得的細(xì)胞形態(tài)具有調(diào)節(jié)性DCs的典型特征和免疫表型，說(shuō)明該實(shí)

6、驗(yàn)建立的培養(yǎng)調(diào)節(jié)性DCs的方法是切實(shí)可行的。2.CD11clowCD45RBhighDCregs這種新亞群具有較強(qiáng)的吞噬能力，刺激T淋巴細(xì)胞的增殖能力較弱，為調(diào)節(jié)性DCs誘導(dǎo)免疫耐受的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：構(gòu)建人源化BALB/c裸鼠慢性粒細(xì)胞白血病(CML)模型，為CML各種治療手段的研究提供實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物模型。
　　方法：1、BALB/c裸鼠預(yù)處理：將4周齡BALB/c裸鼠在無(wú)菌條件下行脾切除術(shù)，環(huán)磷酰胺腹腔注射

7、及全身亞致死量照射預(yù)處理(SCI預(yù)處理)。2、細(xì)胞準(zhǔn)備：分離初診的CML患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以無(wú)菌的PBS調(diào)整濃度15×107/mL，即4.5×107個(gè)/0.3mL。3、細(xì)胞接種：將人的單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈注入SCI預(yù)處理過(guò)的裸鼠體內(nèi)(4.5×107個(gè)/只)。實(shí)驗(yàn)分組：A組：?jiǎn)渭冾A(yù)處理組，對(duì)裸鼠進(jìn)行SCI預(yù)處理后，經(jīng)尾靜脈注入0.3 mL的PBS；B組：白血病細(xì)胞接種組，接種細(xì)胞為CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞。4、觀(guān)察裸鼠的體重、飲食變

8、化，裸鼠經(jīng)預(yù)處理后體重明顯下降，當(dāng)體重漸增至正常再次出現(xiàn)消瘦時(shí)開(kāi)始尾靜脈取血，觀(guān)察血象及細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)人CD13、CD45的表達(dá)，將惡病質(zhì)裸鼠處死取骨髓病理學(xué)檢查及RT-PCR檢測(cè)bcr/abl融合基因。
　　結(jié)果：1、CML細(xì)胞接種組的裸鼠靜脈輸注人的單個(gè)核細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，裸鼠會(huì)出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)度減低，食量下降，消瘦，脊背拱起，最后出現(xiàn)惡病質(zhì)而死亡。生存時(shí)間為46±4.2 d(45～57 d)。2、人CD13

9、、CD45抗原細(xì)胞的表達(dá)：白血病接種組，第3周檢測(cè)到外周血CD13和CD45雙陽(yáng)性的細(xì)胞占2.56％±0.36%，第6周占4.97%±0.43%，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而單純預(yù)處理組第3周和第6周分別為0.56%±0.05%，0.44%±0.07%，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3、裸鼠經(jīng)過(guò)接種白血病細(xì)胞后，第3周的血片可以觀(guān)察到原始細(xì)胞，比例為2.6±0.9%(1%～4%)，病程后期，裸鼠處