高親和力CD34人源化抗體的制備及鑒定.pdf

1、CD34是分子量約為110kDa的穿膜糖蛋白，是目前所知的最早期、最廣泛表達(dá)于人類HSC上的膜抗原。在臨床造血干細(xì)胞移植中，CD34單抗已被廣泛用于純化造血干細(xì)胞。但現(xiàn)有的抗人CD34單克隆抗體均為鼠源，進(jìn)入人體后可能誘發(fā)人抗鼠抗體免疫應(yīng)答(HAMA)。因此，為了提高造血干細(xì)胞移植的安全性，我們擬制備新型的抗CD34人源化抗體，以降低其免疫原性，提高其在臨床使用中的安全性。 首先采用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備了三株抗人CD34單克隆抗

2、體(5B12、4C8和2E10)，利用試劑盒檢測(cè)其亞型分別為(IgG2a,k)、(IgG1，k)和(IgG3,k)；流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，與商品化的CD34單抗581對(duì)照一樣，該三株抗體都能與表達(dá)CD34抗原的KG-1a細(xì)胞特異性結(jié)合；Western blotting分析進(jìn)一步證實(shí)它們特異性識(shí)別CD34分子；表位鑒定結(jié)果表明5812、4C8和2E10分別識(shí)別CD34分子的I、II、Ⅲ類表位。我們采用5'RACE技術(shù)獲得了5812、4C8

3、和2E10的可變區(qū)全長(zhǎng)cDNA，將可變區(qū)基因序列輸入計(jì)算機(jī)在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索，證明是新克隆的抗體基因。 在獲得5812、4C8和2E10這三株單抗的可變區(qū)基因之后，我們將它們分別與人源抗體的恒定區(qū)連接，然后將嵌合抗體輕、重鏈基因分別克隆到真核表達(dá)載體，最后將嵌合抗體輕、重鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)抗體蛋白的CHO細(xì)胞克隆。獲得的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)Protein A親和分離純化，獲

4、得純度在90％以上的CD34嵌合抗體c5812、c4C8、c2E10；抗原結(jié)合活性結(jié)果表明該三株嵌合抗體都能很好地與KG-1a細(xì)胞結(jié)合；競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們都能與各自對(duì)應(yīng)的鼠源抗體競(jìng)爭(zhēng)，而且它們的IC50值相似，說明三株嵌合抗體都保留了與各自對(duì)應(yīng)的鼠源抗體相似的親和力和特異性。 為了進(jìn)一步減小嵌合抗體的免疫原性，我們利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對(duì)II類CD34單抗4C8進(jìn)行人源化改造。在確定了4C8可變區(qū)中CDR區(qū)和FR區(qū)的范圍之后，

5、我們將CDR區(qū)直接移植到人源抗體模板的FR中，構(gòu)建CDR移植抗體，并將獲得的人源化輕、重鏈抗體基因克隆到表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其抗原結(jié)合活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)人源化抗體的親和力基本完全喪失。為了重建人源化抗體的親和力,我們利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對(duì)可能影響抗體親和力的FR區(qū)重要?dú)埢M(jìn)行回復(fù)突變分析,分別構(gòu)建了5條不同的人源化重鏈和5條不同的人源化輕鏈,經(jīng)過活性篩選,我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于人源化重鏈來說,框架區(qū)殘基2,46,68,69,8

6、2,91的回復(fù)突變是必要的,將它們?nèi)客蛔優(yōu)槭笤礆埢蟮玫搅艘粋€(gè)活性超過嵌合抗體重鏈的人源化重鏈4C8VHb。我們采用同樣的方法對(duì)人源化輕鏈基因進(jìn)行改造,發(fā)現(xiàn)將輕鏈框架區(qū)殘基3,4,46全部回復(fù)突變獲得的人源化輕鏈4C8VLb與4CSVHb組成的人源化抗體h4C8的抗原結(jié)合活性超過了嵌合抗體c4C8,在篩選得到高親和力的人源化抗體h4C8之后,我們又建立了高效表達(dá)h4C8的CHO-K1細(xì)胞株,為今后的實(shí)驗(yàn)和臨床研究打下了基礎(chǔ)。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)