TGF-b信號中TGF-bRⅡ的突變對膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機制.pdf

1、背景及目的：
　　 轉(zhuǎn)化生長因子beta 1（TGF-β1）信號通過Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體（TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ）途徑，可抑制腫瘤細胞生長。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞常常通過TGF-β受體的下調(diào)或者突變，逃避TGF-β信號對其生長抑制作用。但是，TGF-β1 激活的信號還能促進腫瘤細胞遷徙，具有促腫瘤的作用，這就是著名的TGF-β“雙向”作用。惡性腫瘤細胞如何逃避TGF-β信號的生長阻滯作用，并促進腫瘤轉(zhuǎn)移能力，

2、其機制仍不完全清楚。本研究旨在探討TGF-ΒrⅡ的表達和分子狀態(tài)在膀胱癌腫瘤中的作用及其機制，以及與臨床關(guān)系及其意義，為以其為靶點的腫瘤干預策略提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.TGF-β1 及其TGF-β受體在多種腫瘤細胞系中的表達檢測
　　 1）應(yīng)用Real-time PCR檢測各種腫瘤細胞系（乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，子宮頸癌，白血病，前列腺癌，黑色素瘤及膀胱癌細胞）中TGF-ΒrⅠ，TGF-ΒrⅡ，

3、TGF-β1的表達。
　　 2）應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）檢測L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87細胞表面TGF-ΒrⅡ的表達，胞漿中TGF-β1的表達。
　　 3）應(yīng)用細胞免疫組化法（細胞爬片）檢測L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87細胞表面的TGF-ΒrⅡ的染色程度。
　　 2.L02，ScaBER和T24細胞中TGF-β信號的阻斷試驗
　　 1）

4、將本室構(gòu)建的可溶性II 型TGF-β受體（Fc:TβRII；與TGF-ΒrⅡ競爭結(jié)合TGF-β1，阻斷TGF-β信號通路）轉(zhuǎn)染至實驗細胞中，應(yīng)用Western blot 方法檢測細胞上清中Fc:TβRII的表達。
　　 2）將Smad2/3的siRNA 轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，應(yīng)用抗Smad2/3 抗體，Western blot的方法檢測細胞中Smad2/3的表達。
　　 3.TGF-ΒrⅡ?qū)δ[瘤細胞生長、細胞活力影響的實驗

5、>　　 1）用PKH-26 將目的細胞染色后，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測48 h后各組細胞的增殖水平（用刺激指數(shù)表示）。
　　 2）應(yīng)用Transwell 實驗檢測腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況，用蘇木素-伊紅染色后隨機選取五個視野計數(shù)分組：①對照組；②Fc:TβRII 轉(zhuǎn)染組；③TGF-β1 刺激組；④Si-Smad2/3組。
　　 4.膀胱癌細胞及組織標本中TGF-ΒrⅡ序列測定，及其突變分析
　　 首先，針對TGF-Β

6、rⅡ編碼區(qū)第383-2086bp 設(shè)計TGF-ΒrⅡ的測序引物；應(yīng)用RT-PCR方法進行TGF-ΒrⅡ基因擴增；然后，利用瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行產(chǎn)物回收，純化；送至上海英駿公司進行序列測定；利用pubmed中BLAST 將測序結(jié)果與TGF-ΒrⅡ基因序列進行比對分析。
　　 5.檢測膀胱癌細胞中TGF-β1/TGF-ΒrⅡ信號激活的下游通路
　　 1）應(yīng)用Western blot 檢

7、測TGFβ經(jīng)典信號通路中的Smad 磷酸化形式pSmad 蛋白的表達。
　　 2）應(yīng)用IP（免疫共沉淀）檢測TGF-ΒrⅡ復合體與Smad的結(jié)合。
　　 3）在TGFβ1（2 ng/ml）刺激0 h，2 h和4 h 不同時間段，應(yīng)用Real-time PCR檢測L02，ScaBER和T24細胞中增殖相關(guān)基因p15，細胞分裂周期蛋白Cdc25A及促遷移活性的轉(zhuǎn)錄因子CUTL1的表達。
　　 4）在TGFβ1（2 n

8、g/ml）刺激0 h，4 h和8 h 不同時間段，應(yīng)用Western blot 檢測實驗細胞中增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。
　　 6.從膀胱癌標本中分離原代細胞后，檢測TGFβ信號對TGF-ΒrⅡ突變?nèi)海╝）與未突變?nèi)海╞）生物學特性的影響
　　 1）從膀胱癌組織標本中分離原代膀胱癌細胞。
　　 2）應(yīng)用免疫組化試驗檢測a組和b組細胞表面TGF-ΒrⅡ的表達。
　　 3）利用FCM 檢測膀胱癌原代細胞的

9、增殖能力（SI）分組：①0 h 對照組；②24 h 對照組；③24 h 刺激組（TGF-β1）。
　　 4）利用Transwell 侵襲轉(zhuǎn)移試驗檢測膀胱癌原代細胞的活力和遷移能力；分組：①對照組；②TGF-β1 刺激組；③Fc:TβRII 轉(zhuǎn)染組。
　　 5）利用RT-PCR檢測TGF-β1 刺激0 h，2 h和4 h后，a,b 兩組中p15，Cdc25A和CUTL1的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.TG

10、F-β1在大多數(shù)腫瘤細胞中過表達，而TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ在多種人類腫瘤細胞表面低表達，僅僅在人類膀胱癌細胞株T24表面，TGF-ΒrⅡ高表達，通過序列分析，在跨膜區(qū)的116 位，118 位，以及胞漿段269 位發(fā)生點突變；269 位的Ser/Thr 激酶域的G→A（Glu269 → Lys）點突變，致使蛋白質(zhì)變性，由酸性氨基酸轉(zhuǎn)換為堿性氨基酸。
　　 2.在TGF-β1 刺激下，IP 試驗證明上述突變不影響TGF-Βr

11、Ⅱ與Smad2/3的結(jié)合，而且增殖試驗結(jié)果表明TGF-ΒrⅡ的突變，反而解除了TGF-β1 信號對腫瘤生長的抑制作用；Transwell 試驗說明發(fā)生點突變的TGF-ΒrⅡ/TGF-β信號能促強腫瘤細胞的運動和遷移能力。
　　 3.進一步運用RT-PCR和Western blot 試驗，對下游細胞增殖相關(guān)基因p15和Cdc25A 及動力相關(guān)基因CUTL1的檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-ΒrⅡ突變體介導的信號途徑能下調(diào)p15的表達，上調(diào)Cdc

12、25A的表達，同時提高CUTL的表達，不抑制腫瘤的生長，而且促進了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.膀胱癌細胞系以及原代膀胱癌細胞中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Fc:TβRII或Smad2/3的siRNA，TGF-β信號被阻斷；發(fā)生TGF-ΒrⅡ突變的癌細胞群中，p15和Cdc25A的表達無明顯變化，但CUTL1的表達明顯上調(diào)；
　　 5.在膀胱癌標本中，TGF-ΒrⅡ基因發(fā)生的G→A 點突變（與膀胱癌細胞系T24中的TGF-ΒrⅡ

13、突變類型一致）比例高達39.1％，與膀胱癌臨床分期中的T2級（P=0.007，＜0.01）以及病理分級的高級別瘤（P=0.003，＜0.01）密切相關(guān)。
　　 結(jié)論:本實驗研究首次發(fā)現(xiàn)TGF-ΒrⅡ在膀胱癌細胞系中的點突變，與膀胱移行上皮癌T24的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并在高轉(zhuǎn)移，高侵襲的膀胱癌病人的腫瘤標本中發(fā)現(xiàn)同樣的突變類型，說明TGF-ΒrⅡ的點突變很可能為膀胱癌轉(zhuǎn)移的重要標志，這為TGF-β1 信號在腫瘤發(fā)生中的所發(fā)揮的調(diào)節(jié)