金黃色葡萄球菌A型腸毒素單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起化膿性疾病的重要病原菌,其產(chǎn)生的腸毒素則是世界范圍內(nèi)引起食物中毒的重要因?yàn)橹弧Ｆ渲幸訟型腸毒素引起食物中毒的發(fā)生率最高,因此,建立敏感、快速的檢測(cè)金黃色葡萄球菌A型腸毒素(Staphylococcal aureusenterotoxins A,簡(jiǎn)稱SEA)的方法,是進(jìn)行食品安全檢測(cè),預(yù)防食物中毒的必要條件,也有助于金黃色葡萄球菌感染所致化膿性疾病的早期診斷,具有重要的臨床意義和衛(wèi)生意義?？筍EA單克隆抗體的應(yīng)用,能

2、夠有效地提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。目前,國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還不能提供有效的抗SEA單克隆抗體。因此,為了適應(yīng)臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究的需要,本研究制備了抗SEA單克隆抗體,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌A型腸毒素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。
　　 本試驗(yàn)用SEA經(jīng)多次免疫BALB/c小鼠后,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50％PEG的作用下進(jìn)行融合。用間接ELISA方法初步篩選出能分泌抗SEA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,用有限稀釋法

3、進(jìn)行克隆化,直到克隆后的細(xì)胞孔達(dá)到100％陽(yáng)性,即篩選到了只分泌一種抗體的雜交瘤細(xì)胞。本試驗(yàn)共篩選到三株雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3C1、3G10和2A10。對(duì)其進(jìn)行鑒定,結(jié)果如下:在經(jīng)4個(gè)月的連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存6個(gè)月后復(fù)蘇檢測(cè),其分泌抗體的能力差異不顯著,表明其穩(wěn)定性好:其染色體平均數(shù)目在87～98條之間；經(jīng)亞類鑒定,三株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體類型均為IgG1亞類,輕鏈類型均為k鏈； ELISA交叉試驗(yàn)和Western-blot分析結(jié)果表

4、明,三株抗金黃色葡萄球菌A型腸毒素的單克隆抗體與B型腸毒素、C1型腸毒素?zé)o任何交叉反應(yīng),且能特異性地與A型腸毒素結(jié)合；經(jīng)抗原表位特異性分析,三株單克隆抗體的識(shí)別表位相同或相近；其相對(duì)親和力的測(cè)定結(jié)果是3C1>3G10>2A10；抗體的效價(jià)水平為3C1>3G10>2A10,其中3C1株雜交瘤細(xì)胞的腹水效價(jià)達(dá)1:819200。以3C1雜交瘤細(xì)胞株的腹水型抗體為原料,建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌A型腸毒素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的

5、系列優(yōu)化,最終確定其反應(yīng)條件如下:包被濃度為0.8μg/mL,包被條件為37℃2h；封閉條件為0.5％BSA封閉液37℃1h；抗體工作濃度為1:9600,樣品和抗體的加樣比為30:70,競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為37℃1h；酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?:6000,反應(yīng)時(shí)間為37℃30min；顯色條件為37℃避光反應(yīng)10min。在該反應(yīng)條件下,獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為y=-0.2902x+0.8338,相關(guān)系數(shù)r=0.9952,檢測(cè)限為0.7311 ng/mL

6、,能滿足目前對(duì)食品中腸毒素的檢測(cè)要求。批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.22％～13.47％和9.31％～13.47％,具有較好的重復(fù)性和精確度；與B型和C1型腸毒素沒(méi)有任何交叉反應(yīng),表明該方法的特異性強(qiáng)。用建立的檢測(cè)A型腸毒素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)肉制品中添加的SEA進(jìn)行檢測(cè)。其定量限為0.8557ng/mL,平均回收率在60～120％之間,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均<20％,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的檢測(cè)金黃色葡萄球菌A型腸毒素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法可