Toll樣受體2和腸三葉因子對炎癥性腸上皮細胞屏障的保護作用機制研究.pdf

1、前言：
　　炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）為一類反復(fù)發(fā)作的胃腸道慢性非特異性炎癥。發(fā)病率逐年增高，可見于任何年齡，但20歲以下患兒占IBD總數(shù)的25％-30％。IBD是兒童和青少年時期重要的慢性胃腸道疾病，具有慢性、反復(fù)發(fā)作的疾病特點，嚴重影響了患者的生長發(fā)育和生活質(zhì)量。迄今為止，IBD的病因和發(fā)病機制仍不明確，國內(nèi)外大多學(xué)者認為是由大量腸道細菌誘發(fā)的過度腸黏膜免疫反應(yīng)，在具有遺傳易感性

2、的人群中導(dǎo)致腸黏膜損傷。近年來，人們對IBD發(fā)病及治療有了新的認識，認為不論是腸道的原發(fā)性病變，還是繼發(fā)性損害，均會造成腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的損傷。因此研究腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能，有效維持和修復(fù)腸黏膜屏障，可望成為治療IBD的新策略。
　　腸黏膜屏障是指腸道能夠防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)如病原體和毒素通過腸黏膜進入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和，它在防御外來抗原物質(zhì)對機體的侵襲，保持機體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，維持機體的正常生

3、命活動等方面有重要的作用。腸黏膜屏障的組成可歸納為三部分:①機械屏障即腸上皮和腸黏液;②生態(tài)屏障即正常腸道菌群;③免疫屏障即分泌性IgA、黏膜下和黏膜內(nèi)各種免疫細胞。腸上皮屏障的完整及腸黏液成分的穩(wěn)定在維持整個腸黏膜屏障功能及腸道穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。腸上皮屏障主要由完整的腸上皮細胞和細胞間的緊密連接等組成，能夠維持正常的腸黏膜通透性。本研究將通過體外培養(yǎng)Caco-2細胞單層，模擬人腸上皮細胞屏障。
　　Toll樣受體(tol

4、l-like receptor，TLR)是天然免疫系統(tǒng)中的一種細胞跨膜糖蛋白，通過對病原微生物的識別觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而激活免疫系統(tǒng)，是一種識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的模式識別受體。TLRs可表達于腸上皮細胞中，并介導(dǎo)微生物與絀胞之間的相互作用，與黏膜耐受和保護有密切關(guān)系，對維護正常的腸黏膜屏障必不可少。TLRs信號途徑可以引起緊密連接蛋白ZO-1向細

5、胞頂部緊密連接處轉(zhuǎn)移，從而增強腸上皮屏障的完整性。在小鼠結(jié)腸炎模型中，TLR2配體PCSK可以保護緊密連接相關(guān)的腸屏障完整性，降低腸通透性;而TLR2基因缺失鼠則修復(fù)延遲或無修復(fù)反應(yīng)。
　　腸三葉因子(intestinal trefoil factor，TFF3)是一種主要由杯狀細胞分泌的短肽蛋白，是腸黏液的主要組成成分，在腸道的損傷愈合和修復(fù)方而起著重要作用。TFF3基因缺失小鼠對化學(xué)性、放射性、缺氧性腸道損傷極為敏感并難以恢復(fù)

6、，將外源性的重組TFF3經(jīng)口灌胃給TFF3基因缺失的結(jié)腸炎小鼠，可加快其黏膜修復(fù)。
　　TFF3是目前發(fā)現(xiàn)與腸損傷防御和修復(fù)關(guān)系最為密切的生長因子類多肽物質(zhì);TLR2不但在腸道先天免疫中占據(jù)重要地位，而且在腸上皮屏障保護中扮演著重要角色。那么，TLR2和TFF3對腸上皮細胞屏障保護作用的具體機制如何？它們之間又是否存在某種關(guān)聯(lián)？如能揭示這些問題不僅補充了腸道免疫屏障與腸道機械屏障相互作用的具體機制，更為進一步以TLR2或TFF3為

7、靶點，研制新型的維持和修復(fù)腸黏膜屏障的有效藥物奠定了理論與實驗基礎(chǔ)。
　　實驗材料及方法：
　　一、細胞培養(yǎng)
　　Caco-2細胞株，人克隆結(jié)直腸腺癌細胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫，結(jié)構(gòu)和功能近似于分化的人腸道上皮細胞，國際上廣泛應(yīng)用于體外模擬人腸道上皮細胞骨架、連接結(jié)構(gòu)和通透性研究，也用于信號傳導(dǎo)通路及細胞因子等研究。應(yīng)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng)，每5

8、d按1∶2的比例傳代。細胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞生長融合至80-85％左右收集，分別接種于6孔板和Transwell24孔板，培養(yǎng)21天形成細胞單層，按實驗分組給予慢病毒轉(zhuǎn)染、試劑干預(yù)，進行后續(xù)實驗。每種實驗均選取至少三組非同代細胞進行。
　　二、實驗分組
　　細胞按是否應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染分為4組:
　　Caco-2組:正常Caco-2細胞單層。
　　siTLR2組:TLR基因沉默Caco-2細胞單層，正常Caco-

9、2細胞單層與siTLR2慢病毒作用96小時。
　　TFF3組:TFF3基因過表達Caco-2細胞單層，正常Caco-2細胞單層與TFF3過表達質(zhì)粒慢病毒作用96小時
　　TLR2組:TLR2基因過表達Caco-2細胞單層，正常Caco-2細胞單層與TLR2過表達質(zhì)粒慢病毒作用96小時
　　每組細胞再按不同干預(yù)條件分為3組:
　　正常對照組:未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染后Caco-2細胞單層不做處理。
　　炎癥組:未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)

10、染后96小時Caco-2細胞單層，用IL-1β10 ng/ml處理48小時。
　　抑制劑組:炎癥組細胞IL-1β處理前1小時，用PI3K/Akt通路抑制劑LY29400225μM處理1h。
　　各組細胞單層均于實驗第21天收集，檢測。
　　三、實驗方法及檢測指標
　?。ㄒ唬w外正常及炎癥性腸上皮細胞屏障模型的建立
　　應(yīng)用Caco-2細胞株在Transwell24孔板上培養(yǎng)21天建立正常腸上皮細胞單層屏障，

11、再給予IL-1β處理，形成炎癥性腸上皮細胞屏障模型，并應(yīng)用跨膜電阻(TEER)檢測腸上皮細胞屏障的形成情況。
　?。ǘ㏕LR2和TFF3對腸上皮細胞屏障通透性的作用
　　1、跨膜電阻(TEER)檢測反應(yīng)腸上皮細胞屏障的通透性及完整性，用Millicell-ERS跨膜電阻儀測定細胞的跨膜電阻值，分別于IL-1β處理不同時間檢測TEER值及TLR2和TFF3蛋白含量。
　　2、檢測正常對照組和炎癥組中，未轉(zhuǎn)染細胞、TLR

12、2沉默細胞、TLR2或TFF3過表達細胞TEER值。
　　（三）TLR2和TFF3對腸上皮細胞屏障緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的影響
　　通過Western blot檢測正常腸上皮細胞屏障和炎癥性腸上皮細胞屏障中，未轉(zhuǎn)染細胞、TLR2沉默細胞、TLR2或TFF3過表達細胞緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1水平。
　　(四)TLR2和TFF3對腸上皮細胞屏障炎性細胞因

13、子TNF-α，IL-6，IL-8的影響
　　應(yīng)用Elisa法檢測正常腸上皮細胞屏障和炎癥性腸上皮細胞屏障中，未轉(zhuǎn)染細胞、TLR2沉默細胞、TLR2或TFF3過表達細胞炎性細胞因子TNF-α，IL-6，IL-8的釋放。
　?。ㄎ澹㏕LR2與TFF3之間的關(guān)系
　　通過RT-PCR和Western blot分別檢測正常腸上皮細胞屏障和炎癥性腸上皮細胞屏障中，未轉(zhuǎn)染細胞、TLR2沉默細胞、TLR2或TFF3過表達細胞TLR2

14、和TFF3mRNA值和蛋白表達情況。
　　（六）TLR2和TFF3與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系
　　給予炎癥組細胞PI3K/Akt通路抑制劑后，分別檢測未轉(zhuǎn)染細胞、TLR2沉默細胞、TLR2或TFF3過表達細胞TLR2和TFF3 mRNA值和蛋白表達情況，Akt和p-Akt蛋白水平，緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表達，炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8釋放，與正常對照組及炎癥組細胞比較

15、，研究TLR2和TFF3之間的相互作用以及TLR2和TFF3對緊密連接蛋白、炎性細胞因子的影響是否由PI3K/Akt通路介導(dǎo)。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有實驗均重復(fù)3次以上，結(jié)果用Mean±SD表示，統(tǒng)計由SPSS13.0軟件完成。采用One-Way ANOVA法比較總體和組間差異，P＜0.05認為有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　一、利用Caco-2細胞建立體外腸上皮細胞屏障
　　Caco-2細胞隨著培養(yǎng)時

16、間的延長，逐漸融合成片，成單層生長，光鏡下呈多角形、不規(guī)則多邊形或鵝卵石樣，相鄰細胞連接緊密，可見致密的反光帶。至21天左右，細胞形成緊密單層，緊密連接形成，建立了一個極性的上皮細胞層。在極性的Caco-2細胞檢測TEER用于評價單層完整性的形成，認為TEER值＞450Ω/cm2反應(yīng)功能性的極性形成。Caco-2細胞單層從培養(yǎng)第5天開始每2天檢測TEER值至第21天，TEER從第5天至第15天逐漸增加，在第15天已經(jīng)達到600Ω/cm2

17、，并到達平臺期保持至第21天，TEER穩(wěn)定在600-700Ω/cm2。體外腸上皮細胞屏障建立，可用于后續(xù)實驗。
　　二、IL-1β對Caco-2細胞單層屏障通透性及TLR2和TFF3蛋白表達的影響
　　炎癥組Caco-2細胞單層從培養(yǎng)第5天開始每2天用10ng/ml IL-1β處理2h，之后檢測TEER值，至第21天。結(jié)果顯示，炎癥組細胞TEER值均低于正常組細胞，并且直至第21天仍＜500Ω/cm2，可見IL-1β對Cac

18、o-2細胞單層通透性存在穩(wěn)定降低作用。Caco-2細胞單層用IL-1β處理不同時間(0，12，24，48，72h)，結(jié)果顯示時間依賴性的TEER逐漸降低，在48h達到最大值，然后在72h輕度增加。因此，選擇IL-1β刺激Caco-2細胞48h制造炎癥性腸上皮細胞屏障模型用于后續(xù)實驗。
　　通過WB檢測TLR2和TFF3蛋白表達水平，TLR2和TFF3蛋白水平在12h輕度增加，然后逐漸降低直至48h，在72h又有輕度增加，這與TEE

19、R對IL-1β處理的改變模式相似。蛋白定量分析顯示，在IL-1β作用48h后TLR2和TFF3水平分別下降約50％和40％，均有統(tǒng)計學(xué)意義。可見TLR2和TFF3與腸上皮細胞屏障通透性具有某種聯(lián)系。
　　三、TLR2和TFF3對炎癥性腸上皮細胞屏障TEER的保護作用
　　研究TLR2和TFF3對炎癥性腸上皮細胞屏障TEER的保護作用。結(jié)果顯示，TLR2基因沉默能夠顯著地降低TEER，無論在正常細胞組(P＜0.01)還是炎癥細

20、胞組(P＜0.05)。而TLR2和TFF3的過表達增加TEER，特別是在炎癥組細胞(P＜0.01)?？梢奣LR2和TFF3能夠防止IL-1β誘導(dǎo)的腸上皮細胞屏障通透性增加。
　　四、TLR2和TFF3對腸上皮細胞屏障緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1蛋白表達的影響
　　總體觀察，無論在正常還是炎癥性腸上皮細胞屏障，TLR2基因的沉默能下調(diào)Occludin，Claudin-1和ZO-1蛋白表達，而TLR

21、2或TFF3基因過表達作用則相反。
　　五、TLR2和TFF3對腸上皮細胞屏障炎性細胞因子TNF-α，IL-6，IL-8表達的影響
　　IL-1β增加炎性細胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的釋放，這種作用被TLR2的沉默顯著增加(p＜0.05)。相反，TLR2和TFF3的過表達顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的TNF-α，IL-6(p＜0.01)和IL-8上調(diào)。說明TLR2和TFF3能夠通過降低炎癥性腸上皮細胞屏障的炎性細胞因子T

22、NF-α，IL-6和IL-8的釋放保護腸上皮細胞屏障。
　　六、TLR2對TFF3的調(diào)控作用及與PI3K/Akt通路活化的關(guān)系
　　TLR2基因的沉默顯著地降低了正常組，炎癥組和PI3K/Akt通路抑制劑組細胞TFF3 mRNA(P＜0.05)和蛋白表達(P＜0.05); TLR2基因的過表達在正常對照組，炎癥組(P＜0.01)和抑制劑組則明顯增加了TFF3 mRNA和蛋白表達。而TFF3基因的過表達對于TLR2 mRNA和

23、蛋白表達均無顯著影響?？梢?，TLR2對于TFF3具有調(diào)節(jié)作用，且此作用不受PI3K/Akt通路抑制的影響，而TFF3的過表達則不能上調(diào)TLR2。
　　七、TLR2與TFF3對炎癥性腸上皮細胞屏障的保護作用與PI3K/Akt通路的關(guān)系
　　為了進一步研究TLR2，TFF3和PI3K/Akt通路的關(guān)系，我們在炎癥組細胞給予PI3K/Akt通路抑制劑，并分別檢測正常對照組，炎癥組和抑制劑組Akt活化情況即磷酸化-Akt的水平。結(jié)果

24、顯示，無論是否給予IL-1β刺激，TLR2沉默下調(diào)p-Akt水平(p＜0.01)，而TLR2或TFF3過表達增加p-Akt水平，并且不影響Akt總水平，這種作用被抑制劑的預(yù)處理消除。
　　TLR2和TFF3能夠上調(diào)IL-1β導(dǎo)致的Caco-2細胞單層TEER下降，但給予PI3K抑制劑預(yù)處理消除了這種作用，提示TLR2和TFF3對炎癥性腸上皮細胞屏障通透性的保護作用依賴于PI3K/Akt通路的激活。
　　TLR2的沉默下調(diào)Oc

25、cludin，Claudin-1和ZO-1，而TLR2或TFF3過表達則上調(diào)Occludin，Claudin-1和ZO-1，但抑制劑預(yù)處理能減弱這種作用。TLR2和TFF3的過表達顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的TNF-α，IL-6和IL-8的上調(diào)，并且這種作用被抑制劑的預(yù)處理消除。提示TLR2和TFF3對緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1和炎性細胞因子TNF-α，IL-6，IL-8的調(diào)控作用有PI3K/Akt通路的參與

26、。
　　結(jié)論：
　　1、培養(yǎng)2-3w的Caco-2細胞具有單層屏障結(jié)構(gòu)，可用于體外模擬人腸道上皮細胞屏障的相關(guān)實驗。
　　2、應(yīng)用IL-1β刺激Caco-2細胞單層可引起細胞炎癥，體外模擬人炎癥性腸道上皮細胞屏障，用于相關(guān)實驗。
　　3、應(yīng)用IL-1β造成Caco-2細胞單層炎癥導(dǎo)致TLR2與TFF3蛋白表達降低，并與TEER降低即屏障功能下降相一致。
　　4、TLR2和TFF3對炎癥性腸上皮細胞單層屏障通

27、透性有保護作用。
　　5、TLR2與TFF3可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的表達，保護腸上皮細胞屏障的完整性進而降低通透性。
　　6、TLR2與TFF3能夠抑制炎癥性腸上皮細胞屏障炎性細胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的釋放，維持腸上皮細胞屏障的功能。
　　7、TLR2對TFF3mRNA及蛋白表達有調(diào)控作用，且不依賴于PI3K/Akt通路。
　　8、TLR2和TFF3對炎癥