空泡型質(zhì)子泵V-ATPases在胃癌增殖侵襲中的作用及山荷葉素干預機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 胃癌是常見消化道惡性腫瘤之一，我國胃癌患者死亡率較高。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是治療失敗及復發(fā)的重要原因，臨床尚缺乏有效的干預措施。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與空泡型質(zhì)子泵(thevacuolarH+-adenosinetriphosphatase，V-ATPases)密切相關。在腫瘤組織中V-ATPases高表達，并能夠感知細胞內(nèi)pH，以ATP為能量，將癌細胞產(chǎn)生的過多的H+泵出細胞外，導致胞外的酸性

2、微環(huán)境。國內(nèi)上海交通大學腫瘤研究所通過RNA干擾技術抑制V-ATPases的基因表達，有效抑制了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但V-ATPases在利用質(zhì)子泵功能維持細胞內(nèi)外特定的pH值同時，又作用于哪些信號通路影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，尚未明確。本研究擬通過沉默胃癌細胞SGC7901中V-ATPases表達，研究V-ATPases與Wnt/B-catenin信號通路之間的關系。
　　 近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些藥物及分子能抑制V-ATPases

3、，如巴弗洛霉素、NIK12192及FR202126等，但尚無相關藥物進入臨床。山荷葉素是傳統(tǒng)中藥山荷葉提取物的主要成分，屬于木脂素類化合物，具有較好的抗腫瘤活性，而對正常細胞毒性很小。但山荷葉素抗腫瘤的確切機制尚未完全清楚。近來有研究表明，山荷葉素能抑制破骨細胞的V-ATPases的活性，且抑制活性與山荷葉素有劑量依賴關系。那么山荷葉素對胃癌細胞V-ATPases是否同樣具有抑制作用，且效應如何？國內(nèi)外尚無相關報道?；谏鲜鲅芯壳疤?，本

4、項目選擇了山荷葉素作為胃癌細胞V-ATPases抑制劑，研究其阻斷Wnt/B-catenin信號通路的作用及與胃癌細胞增殖侵襲的關系。
　　 本實驗分為三個部分:第一部分研究V-ATPases蛋白表達和胃癌臨床病理特征和預后的相關性;第二部分研究沉默V-ATPases基因?qū)ξ赴┘毎鸖GC7901增殖和侵襲能力的影響及機制;第三部分為山荷葉素調(diào)控V-ATPases對胃癌細胞增殖侵襲影響的體內(nèi)外研究。
　　 第一部分、V-A

5、TPases蛋白表達和胃癌臨床病理特征及預后的相關性研究
　　 目的:研究V-ATPases蛋白在胃癌組織中的表達及與臨床病理特征和預后的相關性。
　　 方法:運用免疫組化技術檢測50例胃癌組織、正常組織的V-ATPases蛋白表達水平，并統(tǒng)計分析V-ATPases表達與臨床病理指標和預后的關系。
　　 結果:胃癌組織中V-ATPases蛋白陽性表達率為76％，高于正常組織(30%)。胃癌組織中V-ATPases

6、表達與腫瘤大小(P=0.017)、病理分級(P=0.038)、淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.029)有相關性，與其它臨床病理特征性別、年齡、浸潤深度、脈管浸潤及TNM分期無明顯相關性；在運用Cox回歸單因素模型進行單變量分析中，腫瘤大小、脈管浸潤、淋巴結轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期和V-ATPases是重要的預后影響因素，p值分別為0.000、0.009、0.003、0.000、0.000、0.000。采用Cox比例多因素模型進行多變量分析結果顯示

7、，V-ATPases表達和TNM分期可能是預后的獨立影響因素，p值分別為0.010和0.001。
　　 結論:V-ATPases在胃癌組織中的蛋白表達水平明顯高于正常組織，V-ATPases可能與胃癌發(fā)生、進展相關。V-ATPases蛋白表達與腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉(zhuǎn)移有關，可能是影響胃癌預后的一個重要指標。
　　 第二部分、沉默V-ATPases基因?qū)ξ赴┘毎鸖GC7901增殖和侵襲能力的影響及機制
　　

8、目的:利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默人胃癌細胞株SGC7901的V-ATPases，分析V-ATPases在對胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用及機制。
　　 方法:對于未轉(zhuǎn)染的細胞株、轉(zhuǎn)染siRNA-GAPDH、轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPases的SGC7901細胞株，采用MTT試劑盒測定其細胞的生存率，以及克隆形成試驗計算增殖率;運用AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡;采用Transwell進行細胞侵襲試驗，以確定V-ATPases在

9、胃癌細胞侵襲中的作用；并測定干擾前后SGC7901細胞株中Wnt/β-catenin信號通路中LRP磷酸化及對其下游基因的表達。
　　 結果:SGC7901細胞株經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPases后，細胞的增殖、克隆形成能力顯著降低，凋亡率顯著上升，并表現(xiàn)出劑量依賴關系。Transwell實驗結果提示，轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPase后SGC7901細胞遷移能力下降。以上結果提示，V-ATPases在胃癌的增殖、侵襲中具有一定

10、作用。進一步研究結果顯示，干擾SGC7901細胞株V-ATPases表達后，LRP磷酸化受到抑制，Wnt/β-catenin信號通路中下游基因β-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表達顯著下降(P＜0.05)。
　　 結論:V-ATPases在胃癌細胞株SGC7901增殖、侵襲中具有一定作用，靶向抑制V-ATPases后，胃癌細胞株SGC7901增殖、侵襲能力下降，同時能抑制Wnt/β-catenin信號通路中LRP

11、磷酸化。V-ATPases有望成為治療胃癌新的靶點。
　　 第三部分、山荷葉素調(diào)控V-ATPases對胃癌細胞增殖侵襲影響的體內(nèi)外研究
　　 目的:研究山荷葉素(diphyllin)對胃癌細胞SGC7901增殖和侵襲的影響，并探討與V-ATPases表達、Wnt/β-catenin信號通路的關系。
　　 方法:將不同濃度的diphyllin作用于SGC7901細胞株不同時間，采用MTT試劑盒測定其細胞的生存率，以

12、及克隆形成試驗計算增殖率。采用Transwell進行細胞侵襲試驗，以確定山荷葉素在胃癌細胞侵襲中的作用;并測定山荷葉素作用前后SGC7901細胞株中Wnt/β-catenin信號通路中LRP磷酸化及其下游基因表達的差異。建立裸鼠皮下荷瘤模型，分析diphyllin在裸鼠體內(nèi)對胃癌生長的影響。
　　 結果:不同濃度的diphyllin作用于SGC7901細胞后，細胞的增殖、克隆形成能力顯著降低，凋亡率顯著上升，并表現(xiàn)出劑量依賴關系

13、,48小時IC50為7.8μM。5μM、10μM濃度山荷葉素作用后SGC7901細胞遷移能力下降。同時，diphyllin能抑制胃癌細胞中V-APTase基因及蛋白表達，并降低細胞內(nèi)pH，逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)外pH梯度。進一步研究發(fā)現(xiàn)，山荷葉素能抑制磷酸化LRP表達，并下調(diào)其下游基因B-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表達（P＜0.05）。動物實驗結果顯示，裸鼠在給予diphyllin后，移植瘤體積顯著減小，凈體重較對照組升高，瘤體