整合素ανβ6與MMp-9在胃癌預后及侵襲轉(zhuǎn)移機制中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 整合素αvβ6和MMP-9在胃癌預后中的作用研究
　　目的：
　　檢測整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌組織中的表達，分析兩者陽性表達與預后因子的相關(guān)性，評估它們在胃癌預后監(jiān)測中的作用。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學方法檢測整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在126例原發(fā)性胃癌組織中的表達。
　　2.所有組織樣本的免疫組化染色結(jié)果

2、和各種臨床病理指標之間的相關(guān)性分析，通過卡方檢驗完成評估。
　　3.整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9陽性表達的相關(guān)性分析，通過雙變量相關(guān)分析完成評估。
　　4.患者術(shù)后隨訪3個月一次，兩年之后至少6個月一次，中位隨訪時間為56個月。
　　5.按照整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的不同表達組合，將患者分為四組:αvβ6(+)/MMP-9(+)組、αvβ6(-)/MMP-9(-)組、αvβ6(+)/MMP-

3、9（-）組和αvβ6（-）/MMP-9(+)組，以便分析不同組合在胃癌預后中的相對作用。
　　6.生存曲線之間的差異性由對數(shù)秩(Log-rank)檢驗完成評估，并采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風險回歸模型最終評估獨立的預后因子。
　　結(jié)果：
　　1.整合素αvβ6和MMP-9在126例胃癌患者中明顯高表達，其陽性表達率分別為34.92％和42.06％。
　　2.與整合素αvβ6的陽性表達相關(guān)的臨

4、床因素為Lauren分型、分化、淋巴結(jié)分期和TNM分期（P值分別為0.006，0.038，0.016和0.002），而與MMP-9的陽性表達相關(guān)的臨床因素為分化、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期和TNM分期(P值分別為0.039，0.014，0.033和0.008)。
　　3.通過雙變量相關(guān)分析證實，整合素αvβ6的陽性表達和MMP-9的陽性表達呈密切正相關(guān)。
　　4.Kaplan-Meier生存分析表明，整合素αvβ6陽性表達或MMP

5、-9陽性表達患者的生存時間比整合素αvβ6陰性表達或MMP-9陰性表達患者的生存時間短，而且整合素αvβ6和MMP-9都陽性表達的患者的生存時間最短（P值=0.000）。
　　5.Cox比例風險回歸模型顯示，整合素αvβ6和MMP-9陽性表達、彌散型Lauren分型以及較高的N期、M期和TNM分期是影響胃癌不良預后的因素;只有整合素αvβ6和MMP-9是胃癌不良預后的獨立指標（相關(guān)系數(shù)分別為2.632和1.813，P值分別為0.0

6、03和0.007）。
　　結(jié)論：
　　整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌中的高表達密切相關(guān)，兩個指標聯(lián)合檢測在胃癌患者術(shù)后的預后監(jiān)測中可作為更有效的預測指標。
　　第二部分 整合素αvβ6對MMP-9表達的影響及其在胃癌細胞侵襲中的作用
　　目的：
　　研究整合素αvβ6對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達的影響，以及整合素αvβ6和MMP-9在胃癌細胞侵襲、遷移中的作用。

7、>　　方法：
　　1.選用β6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以上調(diào)人胃癌前GES-1細胞中整合素αvβ6的表達，將GES-1細胞分成三組:對照組、空白質(zhì)粒組和質(zhì)粒上調(diào)組。通過western blot檢測整合素αvβ6的表達，以檢驗β6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果，為進行后續(xù)實驗做準備。
　　2.選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA以干擾人胃癌AGS細胞中整合素αvβ6的表達，將AGS細胞分成三組:對照組、siRNA陰性干擾組和siRNA干擾組。通過western blot

8、檢測整合素αvβ6的表達，以檢驗siRNA的干擾效果，為進行后續(xù)實驗做準備。
　　3.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，分別檢測GES-1細胞和胃癌AGS細胞各組中MMP-9在mRNA水平的表達。
　　4.采用ELISA的方法，分別檢測GES-1細胞和胃癌AGS細胞各組中MMP-9在蛋白水平的表達。
　　5.采用Transwell侵襲小室和細胞劃痕實驗，檢測胃癌AGS各組細胞的侵襲和遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1

9、.人胃癌前GES-1細胞轉(zhuǎn)染β6質(zhì)粒后，經(jīng)western blot證實，整合素αvβ6的表達在質(zhì)粒上調(diào)組明顯上調(diào)，空白質(zhì)粒組中整合素αvβ6的表達相較于對照組沒有明顯差異，說明GES-1細胞中整合素αvβ6的上調(diào)效果明顯，可用于后續(xù)研究。
　　2.人胃癌AGS細胞轉(zhuǎn)染siRNA后，經(jīng)western blot證實，整合素αvβ6的表達在siRNA干擾組明顯下調(diào)，siRNA陰性干擾組中整合素αvβ6的表達相較于對照組沒有明顯差異，說明

10、AGS細胞中整合素αvβ6的干擾效果明顯，可用于后續(xù)研究。
　　3.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，人胃癌前GES-1細胞經(jīng)β6質(zhì)粒過表達上調(diào)整合素αvβ6的表達后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平相較于對照組也隨之上調(diào)，而空白質(zhì)粒組的MMP-9在mRNA水平相較于對照組沒有明顯差異;人胃癌AGS細胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平相較于對照組也隨之下調(diào)，而siRNA陰性干擾組的MM

11、P-9在mRNA水平相較于對照組沒有明顯差異。
　　4.ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)，人胃癌前GES-1細胞經(jīng)β6質(zhì)粒過表達上調(diào)整合素αvβ6的表達后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平相較于對照組也隨之上調(diào)， 而空白質(zhì)粒組的MMP-9的蛋白水平相較于對照組沒有明顯差異;人胃癌AGS細胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平相較于對照組也隨之下調(diào)，而siRNA陰性干擾組的MMP-9的蛋白水平相較于對

12、照組沒有明顯差異。
　　5.Transwell侵襲小室和細胞劃痕實驗檢測后發(fā)現(xiàn)，人胃癌AGS細胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達后，細胞的侵襲和遷移能力相較于對照組也隨之變?nèi)?，而siRNA陰性干擾組的侵襲和遷移能力相較于對照組沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　本部分實驗表明，人胃癌前GES-1細胞經(jīng)β6質(zhì)粒過表達上調(diào)整合素αvβ6的表達后，MMP-9在mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào);人胃癌AGS細胞經(jīng)siRNA干擾

13、下調(diào)整合素αvβ6的表達后，MMP-9在mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，且細胞的侵襲和遷移能力也隨之變?nèi)?。整合素αvβ6通過調(diào)控MMP-9促進了胃癌細胞的惡性生物學行為。該部分研究從細胞的微觀角度解釋了整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌組織中的高表達密切相關(guān)以及在胃癌患者術(shù)后的預后監(jiān)測中的作用。
　　第三部分 ERK/MAPK信號通路介導整合素αvβ6調(diào)控MMP-9機制的研究
　　目的:
　　研究ERK/MA

14、PK信號通路對整合素αvβ6調(diào)控MMP-9影響。
　　方法:
　　1.在β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞中分別加入ERK抑制劑PD98059，通過western blot檢測ERK的表達，以檢驗ERK的干擾效果，為進行后續(xù)實驗做準備。
　　2.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，分別檢測β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞干擾ERK的表達前后MMP-9在mRNA水平

15、的表達。
　　3.采用ELISA的方法，分別檢測β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞干擾ERK的表達前后MMP-9在蛋白水平的表達。
　　結(jié)果:
　　1.ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞后，經(jīng)western blot證實，ERK的表達較未加入PD98059組均明顯下調(diào)，說明這兩種細胞中ERK的抑制效果明顯，可用于后續(xù)研究。

16、
　　2.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平較未加入PD98059組均明顯下調(diào)。
　　3.ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平較未加入PD98059組均明顯下調(diào)。
　　結(jié)

17、論:本部分實驗表明，在β6質(zhì)粒過表達的GES-1細胞和整合素αvβ6高表達的胃癌AGS細胞中分別加入ERK抑制劑PD98059后，隨著ERK表達的明顯下調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平相較于抑制ERK表達前均明顯下調(diào)。這說明ERK介導了整合素αvβ6對MMP-9的調(diào)控，ERK/MAPK信號通路對整合素αvβ6調(diào)控MMP-9進而促進胃癌細胞的惡性生物學行為有重要影響。本部分研究明確了整合素αvβ6胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制