ANXA2在APS IgG-β-,2-GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF表達(dá)中的作用探討.pdf

1、目的：探討單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)在抗磷脂綜合征(APS)患者IgG/β2糖蛋白Ⅰ(β2GPI)復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞組織因子(TF)表達(dá)中的作用。 方法：①構(gòu)建插入人ANXA2cDNA序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-eGFP—ANXA2，酶切及測序鑒定，脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得ANXA2過表達(dá)細(xì)胞。②軟件分析并設(shè)計(jì)合成四條ANXA2特異性shRNA序列，與慢病毒載體pGCSIL—GFP連接，PC

2、R及測序鑒定正確后，與過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，篩選出有效干擾序列并包裝293T細(xì)胞獲得重組慢病毒LV—RNAi—ANXA2，感染單核細(xì)胞株THP-1，驗(yàn)證內(nèi)源干擾效率，建立ANXA2RNAi細(xì)胞模型。③利用純化的APS患者IgG與β2GPI復(fù)合物刺激單核細(xì)胞株THP-1、ANXA2表達(dá)沉默的THP-1細(xì)胞及過表達(dá)ANXA2的293T細(xì)胞一定時(shí)間，觀察不同細(xì)胞TFmRNA水平及TF活性變化，分析ANXA2在此過程中的作用。④將THP

3、-1細(xì)胞膜裂解物與β2GPI、抗β2GPI抗體共沉淀，Westernblotting檢測共沉淀標(biāo)本中ANXA2的存在，觀察天然狀態(tài)下的ANXA2能否與β2GPI結(jié)合。 結(jié)果：①構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES2-eGFP—ANXA2酶切及測序均正確，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，ANXA2mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高。②成功構(gòu)建人ANXA2siRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒并篩選出有效干擾片段；將其包裝293T細(xì)胞后收獲的干擾慢病毒滴度為3×109TU/ml；干

4、擾病毒感染THP-1細(xì)胞后ANXA2的mRNA和蛋白表達(dá)均被沉默，其感染THP-1細(xì)胞的最佳MOI值為100。③APSIgG與β2GPI復(fù)合物能夠增強(qiáng)THP-1細(xì)胞TFmRNA及活性的表達(dá)，而對ANXA2表達(dá)沉默后的THP-1細(xì)胞TF表達(dá)沒有促進(jìn)作用；另外，此復(fù)合物對轉(zhuǎn)染了pIRES2-eGFP-ANXA2的293T細(xì)胞TF表達(dá)具有增強(qiáng)效應(yīng)，證明ANXA2在此過程中起重要作用。④THP-1細(xì)胞膜裂解物與β2GPI、抗β2GPI抗體的共沉