TLR4-NF-κB通路在oxLDL-β2GPI-anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用探討.pdf

1、目的:
　　抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）等自身免疫性疾病患者體內(nèi)存在未成熟和加速發(fā)展的動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)。研究表明，APS及SLE患者血清中高滴度的氧化性低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）/β2糖蛋白Ⅰ（β-2-

2、glycoproteinⅠ，β2GPI）/抗β2GPI抗體(anti-β2GPI)三者復(fù)合物與該類患者體內(nèi)加速發(fā)展的AS高度相關(guān)，然而其具體機(jī)制不詳。
　　本論文重點(diǎn)探討跨膜蛋白toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞及表達(dá)

3、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)分子中的作用。
　　研究方法:
　　(1)油紅O染色觀察oxLDL或oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)磷脂的聚積，并用異丙醇抽提細(xì)胞內(nèi)油紅O，測(cè)定該溶液在520 nm的OD值，定量反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)磷脂的聚積。采用TLR4特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理細(xì)胞，觀察TLR4是否參與此過程。
　　(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qu

4、antitative PCR，RT-qPCR)及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化過程中TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　(3) Western blotting檢測(cè)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物刺激BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化過程中NF-κB p65表達(dá)及其磷酸化情況，并用TAK-242預(yù)處理細(xì)胞，以觀察TLR4對(duì)NF-κB

5、p65表達(dá)及其磷酸化的影響。
　　(4) ELISA檢測(cè)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，并采用TAK-242和PDTC（NF-κB抑制劑）預(yù)處理巨噬細(xì)胞，以分別觀察TLR4和NF-κB對(duì)三者復(fù)合物刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-1的干預(yù)作用。
　　(5) RT-qPCR和 TF活性試劑盒分別檢測(cè)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物刺激BALB/

6、c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TF mRNA表達(dá)和活性變化，并用TAK-242和PDTC預(yù)處理巨噬細(xì)胞，以分別觀察TLR4和NF-κB對(duì)此過程的干預(yù)作用。
　　研究結(jié)果:
　　(1)oxLDL(10μg/mL)/β2GPI(100μg/mL)/anti-β2GPI(100μg/mL)復(fù)合物較oxLDL(10μg/mL)單獨(dú)刺激能誘導(dǎo)更多的BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，且TLR4抑制劑TAK-242(5μM)能明顯抑制oxL

7、DL或oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成。
　　(2)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物能顯著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞過程中TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05)。
　　(3)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物能顯著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化過程中NF-κB p65的磷酸化水平，而TAK-242能

8、明顯抑制這三者復(fù)合物誘導(dǎo)的NF-κB p65的磷酸化。
　　(4)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物能顯著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MCP-1的分泌，而TAK-242和PDTC(20μM)可顯著抑制這種作用。
　　(5)oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物能顯著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TF mRNA水平和活性，該效應(yīng)可被TAK-242和PDTC顯著抑制。
　　結(jié)論:
　

9、　(1)與oxLDL單獨(dú)刺激相比，β2GPI、anti-β2GPI和oxLDL同時(shí)刺激時(shí)，BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能夠攝取更多的oxLDL及表達(dá)更高水平的AS相關(guān)效應(yīng)分子MCP-1和TF，這可能是APS患者體內(nèi)AS加速發(fā)展的重要機(jī)制之一。
　　(2) oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化過程中，TLR4及其下游信號(hào)分子NF-κB被誘導(dǎo)表達(dá)增加，阻斷TLR4可顯著但不完全減少泡