脾酪氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長因子-C在非小細胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移中作用的研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 肺癌，作為我國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，近年來仍有逐漸增高的發(fā)病趨勢。非小細胞肺癌約占全部肺癌的80％，早期診斷困難是其一個重要的特點，約七成的患者確診時已失去了手術(shù)機會，肺癌的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個重要因素。Syk(the Spleen tyrosine kinase，Syk)是一種非受體酪氨酸激酶，長期大量的研究表明其不僅在所有造血細胞中表達，而且在諸如血管內(nèi)皮細胞、鼻成纖維細胞、乳

2、腺上皮細胞及胰腺上皮細胞等非造血細胞中也有廣泛的表達。同時，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的研究中，也發(fā)現(xiàn)了Syk的潛在抑制效應(yīng)。還有進一步的研究證實:Syk在正常的乳腺組織、乳腺癌旁組織以及侵襲性乳腺癌組織中的表達程度逐漸降低，在高度侵襲性乳腺腫瘤中常檢測不到其表達;在胃癌組織中運用RT-PCR法未檢測到syk基因的表達;陳明霞等人運用類似的方法研究了胰腺癌組織，同時也得出了相似的結(jié)論。近年來實驗證實血管內(nèi)皮生長因子-C(vas

3、cular endothelial growth factor-C，VEGF-C)也具有促進淋巴管生成作用，因此又稱為淋巴管生成因子，VEGFR-3是其特異性受體，它們可促進早期淋巴管生成和腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有學(xué)者推測，Syk相關(guān)信號通路可能通過影響淋巴管生成因子VEGF-C/VEGFR-3通路起作用，再從而抑制腫瘤淋巴管的生成。盡管肺癌甲基化方面的研究已經(jīng)很多，但無論在Syk基因表達還是甲基化對其表達調(diào)控方面報道均較少，我們希望通過

4、RT-PCR的方法檢測Syk、VEGF-C在非小細胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織的表達。通過本實驗，我們擬探討脾酪氨酸激酶(Syk)和血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)對非小細胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響以及二者之間的潛在聯(lián)系，達到對Syk與非小細胞肺癌關(guān)系初步研究的目的。
　　 [材料與方法]
　　 1.選取山東大學(xué)第二醫(yī)院自2009年1月到2011年12月期間手術(shù)切除的非小細胞肺癌標本81例，標本包括非小細胞肺癌肺癌組

5、織、癌旁組織和正常肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，應(yīng)用RT-PCR的方法，研究Syk、VEGF-C在非小細胞肺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達，并運用統(tǒng)計學(xué)分析，初步明確肺組織從正常到癌旁組織、肺癌組織的癌變過程中Syk與VEGF-C表達的相關(guān)性，并探討不同年齡、性別、組織類型、分化程度及分期的非小細胞肺癌組織中Syk的表達是否有顯著性差異。
　　 2.細胞侵襲實驗檢測Syk、VEGF-C在非小細胞肺癌組織中的表達，并研究其潛在

6、聯(lián)系。
　　 (1).構(gòu)建攜帶人VEGF-C基因片段的真核表達載體pcDNA3.1-VEGF-C及含有Syk基因片段的真核表達載體pLNCXSyk;
　　 (2).經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人非小細胞肺癌細胞A549;
　　 (3).篩選出穩(wěn)定生長的細胞后，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的方法分別檢測 VEGF-CmR

7、NA和Syk mRNA的表達;
　　 (4).采用transwell小室法構(gòu)建體外侵襲模型進行檢測。
　　 構(gòu)建含人VEGF-C基因的真核表達載體，將其轉(zhuǎn)染至人非小細胞肺癌細胞A549中，并設(shè)置空載組進行對照，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測兩組中VEGF-C的表達，取對數(shù)生長期各組細胞構(gòu)建體外侵襲模型，計算侵襲細胞數(shù)目;同樣方法處理Syk組。分析VEGF-C和Syk的表達與非小細胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

8、及二者之間的相互作用。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1.非小細胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織中Syk表達陽性率分別為4.9％，92.6％，100％，肺癌組織中Syk表達與正常肺組織中及癌旁組織Syk表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，癌組織中的表達低于正常組織中及癌旁組織;非小細胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織中VEGF-C的表達陽性率分別為88.9％，12.3％，2.5％，肺癌組織中VEGF-C表達與正常肺組織及癌旁

9、組織中VEGF-C表達有顯著性差異(P＜0.05)，其表達高于正常肺組織及癌旁組織;正常肺組織及癌旁組織中VEGF-C的表達無顯著性差異(p＞0.05); Syk與VEGF-C的表達呈現(xiàn)負相關(guān)（r=-1.000，P=0.000）;不同性別、年齡的患者，不同組織類型、分化程度及分期的患者其Syk表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 2.RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳證實，VEGF-C在轉(zhuǎn)染組及空載組均有表達，細胞侵襲試驗示轉(zhuǎn)染組

10、侵襲細胞數(shù)為50.29±7.56、空載組為20.143±1.51，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳表明Syk基因在轉(zhuǎn)染組有表達，而空載組則沒有表達，細胞侵襲試驗示轉(zhuǎn)染組侵襲細胞數(shù)為12.29±2.75、空載組為5±1.73，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 [實驗結(jié)論]
　　 1.非小細胞肺癌組織中Syk的表達顯著降低，而VEGF-C的表達顯著增高，兩者表達呈現(xiàn)負相關(guān)。Syk的表達在非小