血管內(nèi)皮生長因子-C在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、顳葉內(nèi)側(cè)癲癇(Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是成人常見的局灶性癲癇。75％左右的MTLE患者因?qū)ΜF(xiàn)有的抗癲癇藥物不敏感而最終發(fā)展成為藥物難治性癲癇，目前臨床上常通過外科手術(shù)切除致癇病灶來控制其癲癇發(fā)作。盡管人們在不斷的探索和研究MTLE的發(fā)病機(jī)制，但截止目前，其具體的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)，一方面，反復(fù)的癲癇發(fā)作常引起大腦產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并伴有血腦屏障的功能損傷。另一方面，神經(jīng)炎癥反應(yīng)和

2、血腦屏障功能損傷又可促進(jìn)MTLE的發(fā)生發(fā)展。這二者之間以正反饋機(jī)制形成一個(gè)惡性循環(huán)，并以此促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。來自MTLE臨床標(biāo)本和動物模型的證據(jù)顯示，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在調(diào)控血腦屏障通透性及神經(jīng)炎癥方面具有重要作用。
　　VEGF家族包括7個(gè)成員，分別是VEGF, VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F，以及胎盤生長因子

3、。既往的研究已經(jīng)對VEGF在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用做了較為全面和深入的研究，包括MTLE。除VEGF外，近年來越來越多的研究開始關(guān)注VEGF-C在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。VEGF-C是一種重要的調(diào)控淋巴管及血管生成的長生因子，通過與其受體VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。已有研究表明，VEGF-C與神經(jīng)炎癥及血腦屏障通透性關(guān)系密切，例如VEGF-C高表達(dá)于缺血性腦卒中及骨髓移植后大鼠大腦的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠

4、質(zhì)細(xì)胞上;VEGF-C及其受體VEGFR-2和VEGFR-3還高表達(dá)于與兒童難治性癲癇密切相關(guān)的結(jié)節(jié)性(Tuberoussclerosis complex，TSC)硬化皮層結(jié)節(jié)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞上;此外，在大鼠的帕金森模型中，VEGF-C可明顯增加其血腦屏障的通透性。那么，VEGF-C在MTLE的表達(dá)模式是怎樣的？其在MTLE發(fā)生中的作用及機(jī)制又是什么？這些都是值得我們關(guān)注和進(jìn)一步研究的問題。
　　因此，在本研究中，我們首先通過

5、實(shí)時(shí)定量PCR，Western blot和免疫組化等技術(shù)觀察VEGF-C及其受體在MTLE患者手術(shù)切除的病灶中的表達(dá)和細(xì)胞定位;然后在匹羅卡品誘導(dǎo)的小鼠MTLE模型中使用Western blot，視頻腦電檢分別測VEGF-C及其受體在MTLE小鼠癲癇發(fā)作的急性期（3小時(shí)），潛伏期（1周）和慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作期（3周）的表達(dá)和對癲癇發(fā)作的影響;同時(shí)使用免疫酶聯(lián)反應(yīng)(Enzyme-linked immuneresponse，ELISA)檢測

6、了VEGF-C及其受體在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對MTLE小鼠海馬中血腦屏障開放的標(biāo)志分子白蛋白(Albumin)，白介素1β（IL-1β）IL-6，IL-17和腫瘤壞死因子α（TNF-α）四種和MTLE發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎癥因子，以及mTOR信號通路(mTOR的激活以p-S6表達(dá)增加為標(biāo)志)的作用。此外，由于在MTLE動物模型中我們發(fā)現(xiàn)VEGF-C可上調(diào)上述致炎因子，加之我們前期研究發(fā)現(xiàn)IL-17在與癲癇發(fā)作高度相關(guān)的大腦發(fā)育障礙中具有重要作用

7、，所以我們還研究了IL-17及其受體IL-17R在MTLE患者手術(shù)切除的病灶中的表達(dá)和分布。通過上述研究，我們得到如下結(jié)果:
　　1.VEGF-C，VEGFR-2和VEGFR-3在MTLE患者致癇灶及腦脊液和血清中的表達(dá)水平較對照組明顯增高。
　　2.免疫組化及熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，VEGF-C高表達(dá)于MTLE病灶的神經(jīng)元，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞上，VEGFR-2高表達(dá)于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，而VEG

8、FR3則僅高表達(dá)于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞上。
　　3.在匹羅卡品誘導(dǎo)的小鼠MTLE模型中，VEGF-C，VEGFR-2和VEGFR-3在癲癇發(fā)作的3h，1w，和3w的蛋白表達(dá)均顯著增高。
　　4.視頻腦電監(jiān)測結(jié)果顯示，VEGF-C可明顯增加MTLE小鼠在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的棘波放電頻率和癲癇發(fā)作次數(shù)，且該效應(yīng)可被VEGFR-2或者VEGFR-3拮抗劑所阻斷。
　　5.VEGF-C上調(diào)MTLE小鼠海馬在上述一個(gè)時(shí)間點(diǎn)白蛋白、IL

9、-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、p-S6的表達(dá)，VEGFR-2拮抗劑可阻斷上述效應(yīng)，VEGFR3拮抗劑可阻斷除白蛋白之外的效應(yīng)。
　　6.IL-17和IL17R在MTLE患者致癇灶中的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增高。
　　7.IL-17和IL-17R高表達(dá)于MTLE病灶的神經(jīng)元，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞上。
　　我們的研究結(jié)果提示，VEGF-C信號通路在MTLE的發(fā)生中具有重要