S100A4在卵巢癌順鉑耐藥中的作用.pdf

1、研究背景
　　卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預后差等特點[1]。由于早期缺乏特異性的診斷手段，超過70％的卵巢癌患者就診時已有盆腔轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移，被確診為中晚期[2]。而對于中晚期及腫瘤細胞減滅術(shù)后的卵巢癌患者，化療是主要的治療手段之一。盡管以鉑類為基礎的聯(lián)合化療取得了一定的進展，但其5年生存率仍未見明顯提高。順鉑是被廣泛應用的一線化療藥物[3]，在多種實體腫瘤中均具有明顯的抗腫瘤活性。然而隨著耐藥現(xiàn)象的出

2、現(xiàn)，其療效不盡如人意。因此，尋找卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點或有效的逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)成為當今卵巢癌治療中亟待解決的關鍵問題。
　　S100A4（S100calcium-bindingproteinA4）是鈣結(jié)合蛋白S100家族成員之一[4]。S100蛋白作為一種鈣傳感器蛋白，通過Ca2+信號轉(zhuǎn)導途徑在細胞周期調(diào)控、細胞增殖分化、細胞黏附運動、酶的激活及細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[5]。許多研究證實，S100A4在腎癌、結(jié)腸癌、胃癌、膽管癌、卵

3、巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性密切相關，并可作為判斷腫瘤復發(fā)及患者預后的有效指標之一[6-10]。
　　那么S100A4在卵巢癌治療具有什么作用？其與順鉑耐藥性之間又具有什么關系呢？這些問題都需要進一步研究。
　　本研究擬以卵巢癌細胞為研究對象，采用Westernblot、實時熒光定量PCR、免疫細胞化學法檢測卵巢癌細胞中S100A4的表達，并分析其與順鉑耐藥之間的關系；其次以卵巢癌順鉑

4、敏感細胞株A2780和耐藥細胞株CP70為研究對象，觀察S100A4重組質(zhì)粒及siRNA沉默S100A4基因?qū)毎樸K敏感性的影響。本研究為S100A4參與卵巢癌順鉑耐藥的形成提供有力的實驗依據(jù)，并為進一步探討其在卵巢癌順鉑耐藥中的作用機制奠定基礎。
　　目的
　　1.觀察S100A4在卵巢癌細胞中的表達；
　　2.觀察S100A4的表達與卵巢癌細胞順鉑耐藥的相關性；
　　3.觀察S100A4重組質(zhì)粒及S100A

5、4siRNA對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響，為進一步分析S100A4成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點提供依據(jù)。
　　方法及內(nèi)容
　　1.以卵巢癌細胞株SKOV3，順鉑敏感細胞株A2780、耐藥細胞株CP70，高轉(zhuǎn)移細胞株HO-8910PM、低轉(zhuǎn)移細胞株HO-8910為研究對象，應用實時熒光定量PCR、WesternBlot觀察S100A4在卵巢癌細胞中的表達。
　　2.以順鉑敏感細胞株A2780和耐藥株CP70為研究對象

6、，采用免疫細胞化學法觀察S100A4在細胞中的表達及亞細胞定位；應用MTT法檢測細胞對順鉑的敏感性差異；實時熒光定量PCR、WesternBlot觀察順鉑處理CP70后S100A4的表達變化，分析S100A4的表達與卵巢癌細胞順鉑耐藥的相關性。
　　3.以順鉑敏感細胞株A2780為研究對象，應用重組DNA技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒S100A4-pEGFP-N1，應用實時熒光定量PCR、WesternBlot觀察轉(zhuǎn)染后S100A4的表達，MT

7、T法觀察卵巢癌細胞順鉑敏感性的變化。
　　4.以順鉑耐藥細胞株CP70為研究對象，應用siRNA技術(shù)沉默S100A4基因，實時熒光定量PCR、WesternBlot觀察轉(zhuǎn)染后S100A4的表達，MTT法觀察S100A4siRNA對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響。
　　結(jié)果
　　1.在5種卵巢癌細胞株中，S100A4在順鉑耐藥細胞株CP70中的表達最高，而在敏感株A2780中表達最低；
　　2.S100A4在A2780

8、及CP70中均為胞漿表達。順鉑對A2780和CP70的IC50值分別為17.09μM和62.10μM。順鉑處理CP70細胞后，S100A4的mRNA及蛋白表達具有劑量及時間依賴性。
　　3.S100A4-pEGFP-N1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細胞后，順鉑對細胞的IC50值較空白對照組的19.06μM上升至轉(zhuǎn)染組的51.09μM，對順鉑耐受性提高了2.69倍。
　　4.S100A4siRNA轉(zhuǎn)染CP70細胞后，S100A4mR

9、NA及蛋白的表達下調(diào)，順鉑對CP70細胞的IC50值較空白對照組的64.38μM下降至轉(zhuǎn)染組的38.12μM，對順鉑敏感性提高了1.69倍。
　　結(jié)論
　　1.S100A4在卵巢癌順鉑敏感細胞株A2780中呈低表達，而在耐藥細胞株CP70中呈高表達，高表達S100A4的CP70細胞對順鉑的敏感性顯著降低，同時順鉑可誘導CP70中S100A4表達的上調(diào)，且其在細胞質(zhì)中發(fā)揮耐藥作用，提示S100A4的高表達與卵巢癌順鉑耐藥密切相