AdEasy-CTLA4Ig與調節(jié)性T細胞延長大鼠移植腎存活時間的實驗研究.pdf

1、器官移植是治療各種終末期器官功能衰竭和腫瘤的最有效方法。但由于排斥反應的存在，使移植物的存活時間、移植后功能以及受體的生存時間、生活質量均不盡人意。免疫抑制劑的問世，特別是環(huán)孢素A(CsA)的問世，雖然使器官移植發(fā)生了里程碑式的進步，但由于免疫抑制劑存在一些根本的缺陷，如非特異性的全身免疫抑制，可使受體易遭受致命的感染；促發(fā)腫瘤；無法阻止慢性排斥反應的發(fā)生與進展；肝腎毒性以及其它并發(fā)癥與副作用，仍然無法從根本上解決問題。 因此，

2、任何從排斥反應的根本、也就是從機體免疫系統(tǒng)的范疇來解決移植免疫排斥問題是當今移植學界研究的熱點。誘導受體的“免疫耐受”狀態(tài)是治療移植后排斥反應最令人憧憬的發(fā)展方向，也是唯一可能在不影響機體免疫狀態(tài)情況下，使移植物與宿主共存的策略。所謂免疫耐受是指受體對供體的器官和組織產生耐受，不排斥，而對第三方的器官和組織有正常的免疫反應。 耐受與排斥是有機的統(tǒng)一體。免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)是機體免疫系統(tǒng)永久存在的的三大原始功能。器官排斥是

3、由T細胞所介導的。T細胞的活化需要雙信號的激活，即MHC/Ag分子與TCR/CD3的結合所構成的第一信號系統(tǒng)，此信號是抗原特異性的。以及由抗原遞呈細胞表面的配體與T細胞表面的共刺激信號結合而成的第二信號系統(tǒng)。第一信號系統(tǒng)與第二信號系統(tǒng)雙重刺激將使T細胞活化，產生一系列的細胞因子，從而產生免疫應答反應。而如果僅有第一信號系統(tǒng)而缺乏第二信號系統(tǒng)的刺激，T細胞將無法活化，將產生免疫無能。第二信號系統(tǒng)包括CD28/B7，CD40/CD154等。

4、CD28/B7是其中最重要的信號通路。 樹突狀細胞(DC)是人體內最強的抗原遞呈細胞，一般分為兩類，即髓樣DC與淋巴樣DC。DC的功能與DC的來源、發(fā)育的成熟程度、環(huán)境等因素關系密切。一方面，DC是體內功能最強的抗原遞呈細胞，它可以引起強烈的免疫應答；另一方面，DC可以誘導免疫耐受，此種DC被稱為耐受性DC(To1-DC)。耐受性DC指表型未成熟，能抑制T細胞反應的DC。目前研究認為，未成熟DC(immatureDC，iDC)是

5、誘導免疫耐受，特別是外周性的免疫耐受原因。 由于耐受性DC的誘導免疫耐受作用，因此，制備耐受性DC是誘導移植耐受的重要方法之一。目前的方法有3種：一為分離耐受性DC，二為應用未成熟DC，三為調節(jié)DC至耐受狀態(tài)。本研究旨在研究利用轉基因(CTLA4-Ig)的方法考察能否使DC維持在未成熟狀態(tài)，從而達到耐受的狀態(tài)。本研究將通過運用CD28的同源分子CTLA4Ig的腺病毒載體以及樹突狀細胞(DC)的作用來阻斷第二信號系統(tǒng)來考察其對于移

6、植物生存的影響。 調節(jié)性T細胞(Treg)是維持機體免疫自穩(wěn)的最主要機制。調節(jié)性T細胞對于外界的刺激能保持沉默，目前認為調節(jié)性T細胞在移植免疫中起負性調節(jié)作用，抑制免疫反應的產生與進展，是維持外周性耐受的主要機制之一。 在體外，對于TCR的刺激，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞表現為“無能”與免疫調節(jié)的作用。在與初始性效應T細胞同時培養(yǎng)或激活之后，Treg可以抑制其分泌細胞因子與擴增作用。它們通過TCR介導激活，但激活后即

7、表現為抗原非特異性。因此，推測其在體內，Treg細胞能否通過TCR傳導的信號激活后，通過與效應性T細胞的直接接觸，直接抑制CD4+與CD8+T細胞的活化、增殖，從而抑制排斥反應的發(fā)生與進展。這是本研究所要證實的猜想。 本實驗分4部分： 1，腎移植模型的建立： 運用顯微外科技術，分別利用Brown-Norway、F344和Lewis作供、受體，建立大鼠腎移植急性排斥反應模型和腎移植慢性腎移植排斥反應模型。在技術上，

8、本研究運用供體腎靜脈與受體左腎靜脈相吻合，不阻斷下肢血流；供體腎動脈與受體腹主動脈想吻合；供體輸尿管膀胱瓣與受體膀胱相吻合的方法建立了新的腎移植模型。并采用供體雙腎整體灌注，同時獲取雙側腎臟作為供體器官，截取下腔靜脈作為右腎靜脈的一部分，首先建立了雙側供腎的移植模型。 2，pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重組腺病毒載體的構建： 運用載體AdEasy構建了pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重組腺病毒載體。并運用P

9、CR和westenblot驗證構建成功。并作pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重組腺病毒載體的體外毒性實驗：利用載體在不同的MOI下轉染腎小管上皮細胞、ECV304細胞。并通過心肌細胞來觀察其對心肌細胞的毒性與搏動的影響。 3，pADeasy-1-CTLA4Ig多途徑誘導大鼠腎臟移植物存活時間延長的實驗研究： 運用合成的pAdEasyCTLA4Ig基因重組腺病毒載體通過不同的方式來處理受體，以觀察其對于移植免疫的作用

10、。通過處理供體器官后直接受體注射、培養(yǎng)樹突狀細胞并轉染pAdEasy-CTLA4Ig來處理受體等方法，考察轉CTLA4Ig基因DC對于移植免疫的作用。并通過轉基因DC的定植實驗來探討DC的作用機制。 4，Treg細胞誘導大鼠移植腎存活時間延長的實驗研究： 通過免疫磁珠方法從外周分離CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，經供體抗原誘導后單獨或聯(lián)合pAdEasy-CTLA4Ig基因重組腺病毒作用于受體，通過大鼠腎移植，考察其對于移

11、植免疫的作用。 本研究所取得的主要結論如下： 1.成功建立了大鼠腎移植模型，包括急性腎移植排斥反應模型，慢性腎移植排斥反應模型，雙側供腎大鼠腎移植模型等。本實驗通過近交系Brown-Norway(BN)和Lewis大鼠，運用顯微外科技術建立了穩(wěn)定的腎移植急性排斥模型。通過近交系F344和Lewis大鼠建立了腎移植慢性排斥反應模型。并通過對供體下腔靜脈的裁剪，成功建立了雙側供腎大鼠的腎移植模型。此模型方法簡單，手術成功率高

12、，受體穩(wěn)定，是一種節(jié)省、實用的器官移植方法。其中雙側供腎大鼠腎移植模型和腎移植慢性排斥反應模型的建立均是國內首先報道。 2.成功構建了AdEasy-1-CTLA4Ig載體。AdEasy是一種新穎的細菌內重組系統(tǒng)，其具有高效、方便、實用的特點。AdEasy系統(tǒng)能正確進行翻譯后的修飾和折疊。另外，它攜帶有熒光基因，能十分方便的觀察目的基因的轉染效果和效率。本研究所合成的AdEasy-CTLA4Ig載體具有高效、低毒的特點。能在目的器

13、官中高效轉染和表達。能十分方便的觀察載體的轉染情況。其在體外無明顯細胞毒性，用AdEasy-CTLA4Ig載體轉染ECV-304細胞后24小時和48小時，細胞存活率與對照組無顯著性差異；轉染心肌細胞后2天、4天，心肌細胞的存活率和搏動率與對照組相比均無顯著性差異。表明AdEasy-CTLA4Ig載體系統(tǒng)安全可靠。 3.DC的體內定植實驗表明，在腎移植的早期，與對照組相比，轉基因的DC定植于脾臟的數量略高，推測其與DC進入受體后，

14、被攝取進入移植腎，然后歸流到淋巴器官脾臟有關。 4.AdEasy-CTLA4Ig可以誘導受體對供體的免疫低反應，延長受體的生存時間。通過1×109pFUAdEasy-CTLA4Ig載體的注射加局部灌注供體器官可以誘導移植免疫低反應，延長移植器官的存活時間。與對照組相比，生存時間由8.83天延長到31.2天，兩者有顯著性差異。組織學檢查顯示實驗組移植腎評分明顯低于對照組，表明用AdEasy-CTLA4Ig可減輕排斥反應對移植腎的損