長、短光周期敏感雄性不育水稻育性差異蛋白研究.pdf

1、雜交水稻技術(shù)極大的提高了我國糧食的產(chǎn)量，以光溫敏核不育水稻為基礎(chǔ)發(fā)展起來的兩系法雜交水稻已在全國大面積推廣應(yīng)用，在保障我國糧食安全方面發(fā)揮著巨大作用。兩系法雜交水稻使用的不育系育性受光溫條件決定，生產(chǎn)中要求其在不育條件下完全敗育作為母本進(jìn)行雜交種子生產(chǎn)，而在可育條件下恢復(fù)育性用于繁殖自身，對這種受光溫條件精細(xì)控制的育性轉(zhuǎn)換特性及機(jī)理的研究是兩系法雜交水稻應(yīng)用的技術(shù)基礎(chǔ)。目前存在兩種育性光溫反應(yīng)完全相反的不育系:長光高溫不育型和短光低溫不

2、育型，這為研究光溫敏核不育水稻的育性變化機(jī)理提供了獨特的材料。
　　對光溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)研究工作持續(xù)了40多年，涵蓋了遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)等各個領(lǐng)域，但對其育性調(diào)控機(jī)理至今沒有完全闡述清楚，短光敏核不育水稻是一類新的種質(zhì)資源，對它育性轉(zhuǎn)換機(jī)理的研究開展的還比較少。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，選用長光敏感不育特性典型的農(nóng)墾58S，短光敏感不育特性典型的D52S為材料，在嚴(yán)格的育性誘導(dǎo)條件下，比較兩類

3、育性光反應(yīng)特性完全相反的材料在不育和可育條件下劍葉、葉鞘及幼穗的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過質(zhì)譜鑒定，生物信息學(xué)分析，qPCR及Western Blot驗證等來分析雄性育性轉(zhuǎn)換過程中發(fā)生的基因表達(dá)事件，旨在為揭示長、短光敏核不育水稻的育性轉(zhuǎn)換機(jī)制提供更多有價值的線索，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.在武漢7月份相同自然溫度條件下，對D52S和農(nóng)墾58S在育性轉(zhuǎn)換敏感期分別進(jìn)行14.5 h長光照、10h短光照處理后統(tǒng)計花粉可染率及自交結(jié)實率

4、，結(jié)果顯示D52S在長光條件下花粉可染率為89.06％，結(jié)實率可達(dá)54.84％，經(jīng)短光照處理后花粉完全敗育。農(nóng)墾58S在長光條件下花粉可染率和結(jié)實率均為0，在短光照處理條件下花粉可染率達(dá)84.68％，后期結(jié)實率為25.43％。說明這兩個材料是由光周期主導(dǎo)的育性轉(zhuǎn)換特性完全相反的光敏核不育系。
　　2.采用雙向電泳技術(shù)分離了兩個不育系在不同光周期處理條件下花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期劍葉、葉鞘及幼穗的蛋白表達(dá)譜，通過質(zhì)譜技術(shù)成功從D52S三

5、個組織中鑒定到53個差異蛋白點，從農(nóng)墾58S三個組織中鑒定到40個差異蛋白點，其中有13個蛋白在兩個品種中都出現(xiàn)且它們在各自品種不育及可育條件下的變化趨勢一致。生物信息學(xué)及蛋白功能聚類分析將這93個差異蛋白點劃分為8個類別:代謝相關(guān)蛋白、次生代謝相關(guān)蛋白、能量相關(guān)蛋白、脅迫與防御蛋白、蛋白合成與加工、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生長和功能未知蛋白。對不同組織的差異蛋白點進(jìn)行整理分析顯示光周期誘導(dǎo)育性轉(zhuǎn)變的一個復(fù)雜的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　

6、　3.利用qPCR技術(shù)對在不同光周期處理下差異表達(dá)明顯且穩(wěn)定的類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶4-香豆酸:輔酶A連接酶9(4CLL9)，查爾酮合酶(CHS)以及糖代謝過程中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合酶1(SUS1)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)CHS和4CLL9的表達(dá)量在D52S和農(nóng)墾58S不育及可育幼穗中均有明顯差異，說明這兩個基因與育性的表現(xiàn)密切相關(guān)，可能是參與光敏育性轉(zhuǎn)換過程的重要因素。
　　4.通過Western Blo

7、t實驗進(jìn)一步驗證CHS，4CLL9在兩個水稻品種不育及可育狀態(tài)下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CHS和4CLL9在D52S可育幼穗中的表達(dá)量均高于不育幼穗，4CLL9在農(nóng)墾58S內(nèi)同樣也是在可育株中表達(dá)量高。分別測定比較兩個不育系幼穗發(fā)育Ⅵ期，Ⅶ期不育及可育株中類黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)在Ⅵ期不育幼穗中的類黃酮物質(zhì)含量高于可育幼穗，但是在Ⅶ期無論是在D52S還是在農(nóng)墾58S中，可育幼穗中的類黃酮物質(zhì)含量都明顯高于不育幼穗，提示CHS和4CLL9蛋白的表達(dá)