犏牛雄性不育相關(guān)蛋白篩選研究.pdf

1、犏牛的雄性不育是由于精子發(fā)生阻滯造成的，由此導(dǎo)致牦牛育種中無(wú)法對(duì)犏牛雜合優(yōu)秀基因的有效利用，在研究犏牛精子發(fā)生阻滯機(jī)制機(jī)理方面，雖然前人已經(jīng)做了一些工作，但是犏牛和牦牛之間睪丸蛋白質(zhì)比較組學(xué)的研究尚未報(bào)道，因此在睪丸蛋白組學(xué)水平篩選可能導(dǎo)致犏牛精子發(fā)生阻滯的重要蛋白并深入研究其功能具有重要的生殖生物學(xué)基礎(chǔ)理論意義。本研究應(yīng)用iTRAQ方法對(duì)牦牛和犏牛睪丸蛋白組進(jìn)行比較研究，鑒定出了256個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，其中大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)

2、激反應(yīng)（特別是炎癥性應(yīng)激）、增強(qiáng)生精細(xì)胞間黏附性或抑制生精細(xì)胞向曲細(xì)精管官腔的遷移，而許多下調(diào)蛋白主要與精子發(fā)生中多種細(xì)胞代謝缺陷和細(xì)胞分化過(guò)程有關(guān)，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)的很多重要蛋白可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關(guān)，這些蛋白將對(duì)犏牛精子發(fā)生阻滯分子機(jī)制的深入研究提供重要信息和切入點(diǎn)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.從犏牛和牦牛睪丸組織切片可以看出，犏牛睪丸曲細(xì)精管外膜萎縮且不規(guī)整，可能是由細(xì)胞凋亡引起的。在牦牛曲細(xì)精管中，從基底膜到管

3、腔分布有各級(jí)生精細(xì)胞，包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形或長(zhǎng)形精子細(xì)胞。然而，在犏牛曲細(xì)精管中，基底膜只分布有單層的精原細(xì)胞，精母細(xì)胞數(shù)量較少，幾乎沒(méi)有圓形或長(zhǎng)形精子細(xì)胞。
　　2.在犏牛和牦牛睪丸表達(dá)差異蛋白中，排在前四位的上調(diào)蛋白是 PTX3，S-100，H1.0和Osteoglycin，其差異倍數(shù)分別為3.8，3.5，3.1和2.9，相比之下，排在前四位下調(diào)蛋白是MHC class II，Ropporin-1，SNRPF prot

4、ein和Protamine2，差異倍數(shù)分別為-6.9，-4.7，-4.5和-4.2。
　　3.大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)激反應(yīng)（特別是炎癥性應(yīng)激）、增強(qiáng)生精細(xì)胞間黏附性或抑制生精細(xì)胞向曲細(xì)精管管腔的遷移。一些高表達(dá)蛋白（ICAM1，微纖絲相關(guān)糖蛋白4（MFAP4），胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白前體7（IGFBP7），Dermatopontin（DPT），整合素α9（ITGA9），整合素β1（ITGB1）可以提高細(xì)胞的粘附力，阻礙生殖細(xì)

5、胞從基底膜脫離向生精小管管腔內(nèi)遷移。
　　4.許多下調(diào)蛋白與精子發(fā)生過(guò)程中各種代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程的缺陷有關(guān)。PIWIL1和TDRD1表達(dá)下降可能影響PIWI或piRNA在保護(hù)生殖細(xì)胞基因組的完整性的功能；Gpx4在精母細(xì)胞中耗竭，引起精子嚴(yán)重異常，這可能也是雄性不育的原因；線粒體細(xì)胞色素BC1復(fù)合體亞基2、7和9的下調(diào)，與阿爾茨海默病的途徑和氧化磷酸化有關(guān)，這可能會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙和犏牛睪丸生殖細(xì)胞凋亡；PSME4是一種大量表達(dá)

6、的核蛋白，PSME4的缺失，導(dǎo)致雄性生育能力明顯下降，總之，參與各種代謝過(guò)程的蛋白表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯。
　　5.本研究通過(guò)對(duì)465個(gè)差異表達(dá)蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路富集，共獲得了15個(gè)顯著富集通路，其中排在前五的是細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（P=0.0003843598），蛋白質(zhì)的消化和吸收（P=0.0007844198），阿爾茨海默氏病（P=0.002146642），核糖體（P=0.004046523）和磷酸戊糖通路（P=

7、0.006084241）。在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路中，整合素及其配體的過(guò)表達(dá)（細(xì)胞外基質(zhì)）可能有助于生精細(xì)胞耐受拉力而不被牽離。通過(guò)對(duì)阿爾茨海默病和氧化磷酸化通路的綜合分析表明，諸如線粒體細(xì)胞色素BC1復(fù)合體亞基等蛋白的下調(diào)可能導(dǎo)致犏牛睪丸細(xì)胞線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡。
　　6.本研究同樣采用iTRAQ方法研究不同發(fā)育階段的犏牛睪丸蛋白組的差異（P1-10月齡，P2-12月齡，P3-14月齡）。P2與P1階段相比，蛋白質(zhì)組分析

8、鑒定出318個(gè)差異表達(dá)蛋白，P3與P1階段相比,共有327個(gè)差異表達(dá)蛋白。P2與P1，P3與P1相比，差異表達(dá)的蛋白GO注釋并沒(méi)有明顯的差異，這可以歸因于它們的早期發(fā)育過(guò)程中的犏牛睪丸生精就受到阻滯。另一方面，P2，P3與P1階段相比，有56共同差異表達(dá)的蛋白，大部分蛋白與催化、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶和蛋白結(jié)合相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，差異表達(dá)的蛋白包括HBPs，Tudor domain containing1，HSPA2，17_HSDXI，