雌激素受體配體對二氫睪酮誘導的內皮細胞保護效應的影響及機制探討.pdf

1、目的:
　　1.研究不同雌激素受體配體和雄激素對內皮細胞增殖效應的影響;
　　2.探討不同雌激素受體配體對雄激素作用的影響。
　　方法:
　　1.采用人主動脈內皮細胞，分別以不同濃度的α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮培養(yǎng)細胞48小時，MTS法檢測細胞增殖活力;qRT-PCR方法檢測cyclin A和VEGF mRNA表達水平，MSD化學發(fā)光法檢測VEGF分泌水平，比較α雌二醇和β雌二醇對VEGF

2、、cyclin A基因表達的影響。RT-PCR和Western blot檢測雌激素受體α和雌激素受體β在mRNA和蛋白水平的表達;激素受體α激動劑PPT和雌激素受體β激動劑DPN干預人主動脈內皮細胞，比較PPT和DPN對人主動脈內皮細胞增殖的影響。
　　2.用不同濃度的二氫睪酮干預人主動脈內皮細胞，在不同時間點(0h，24h，48h)，用MTS方法檢測細胞增殖活力，確定二氫睪酮干預人主動脈內皮細胞的最佳濃度和時間。用不同濃度二氫睪

3、酮(5nM，10nM)干預入主動脈內皮細胞48小時，qRT-PCR、MSD化學發(fā)光和Western blot方法檢測雄激素受體、VEGF、cyclin A和cyclin D的mRNA和蛋白表達水平，比較雄激素受體、VEGF、cyclin A、cyclinD基因表達水平的變化。采用siRNA干擾的方法沉默雄激素受體的表達，在二氫睪酮10nM溶液中培養(yǎng)48小時，以非特異性siRNA干擾組為對照，了解二氫睪酮的促人主動脈內皮細胞增殖作用。

4、r>　　3.分別用不同濃度的α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、染料木黃酮、他莫昔芬、氟維司群、PPT、DPN聯(lián)合二氫睪酮10nM培養(yǎng)人主動脈內皮細胞48小時，用MTS法檢測細胞增殖活性，設單純二氫睪酮10 nM為陽性對照組，了解各種雌激素受體配體對二氫睪酮促人主動脈內皮細胞增殖作用的影響，同時比較雌激素受體α激動劑、雌激素受體β激動劑對二氫睪酮促人主動脈內皮細胞增殖作用的影響。
　　結果:
　　1.α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、

5、他莫昔芬、染料木黃酮對人主動脈內皮細胞增殖的影響:α雌二醇10nM組和100 nM組細胞增殖活力顯著高于對照組，分別增加24％(P＜0.05)和31％(P＜0.05)，100 nM組較10nM組增加更明顯，呈劑量依賴趨勢;β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮組，細胞增殖活力較對照組無顯著統(tǒng)計學差異。
　　α雌二醇和β雌二醇對VEGF、cyclin A表達的影響:α雌二醇100nM組cyclin A mRNA的表達較對照組上調6

6、0％(P＜0.05)，VEGF的表達較對照組無顯著統(tǒng)計學差異。β雌二醇100 nM組cyclin A和VEGF的表達較對照組無顯著統(tǒng)計學差異。
　　雌激素受體α、β亞型在人主動脈內皮細胞增殖中的作用:ERα激動劑PPT0.05 nM，0.1 nM和1nM組，細胞增殖活力較對照組增加，其中PPT1 nM細胞增殖活力較對照組增加24％，有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。ERβ激動劑DPN0.05 nM，0.1 nM和1nM組，細胞增殖

7、活力較對照組無顯著統(tǒng)計學差異。
　　2.二氫睪酮對入主動脈內皮細胞增殖的影響:干預入主動脈內皮細胞48小時，自二氫睪酮5 nM濃度開始，細胞增殖活力顯著增加，呈劑量依賴趨勢。干預48小時較干預24小時，細胞增殖活力增加更明顯，呈時間依賴趨勢。
　　二氫睪酮對人主動脈內皮細胞雄激素受體(AR)、VEGF、cyclinA和cyclin D基因表達的影響:二氫睪酮5 nM和10nM干預人主動脈內皮細胞48小時，AR、VEGF、cy

8、clin A和cyclin D mRNA表達上調，二氫睪酮10nM組上調更明顯(P＜0.05)，呈劑量依賴趨勢。二氫睪酮10nM組，AR蛋白表達較對照組顯著上調(P＜0.05)。二氫睪酮5 nM組和10nM組，VEGF分泌水平較對照組顯著增加(13.38±2.95ng/ml vs.25.55±2.49 ng/ml vs.3.52±0.87 ng/ml, p＜0.05)。
　　雄激素受體在人主動脈內皮細胞增殖中的作用:雄激素受體si

9、RNA200 nM可顯著下調雄激素受體的表達(＞90％)。雄激素受體siRNA200 nM干擾后，二氫睪酮10nM培養(yǎng)人主動脈內皮細胞48小時，細胞增殖活力和DNA合成較相應非特異性siRNA組顯著下降(P＜0.05)。
　　3.不同雌激素受體配體對二氫睪酮誘導的入主動脈內皮細胞增殖的影響:α雌二醇（10nM和100 nM）、染料木黃酮(1μM)和PPT（0.05 nM、0.1 nM和1 nM）聯(lián)合二氫睪酮10nM組，較單純二氫睪

10、酮10nM組無顯著統(tǒng)計學差異;β雌二醇(1nM、10nM和100nM)、乙烯雌酚（1nM、10nM和100 nM）、他莫昔芬（100 nM）、氟維司群（100nM和1000 nM）和DPN（0.05 nM、0.1 nM和1 nM）聯(lián)合二氫睪酮10nM組較單純二氫睪酮10 nM組細胞增殖活力顯著下降。
　　結論:
　　1.不同雌激素受體配體對人主動脈內皮細胞增殖的影響具有差異性。α雌二醇和PPT促進人主動脈內皮細胞增殖;β雌二

11、醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮、氟維司群和DPN對入主動脈內皮的增殖無明顯影響。
　　2.二氫睪酮通過雄激素受體途徑促進人主動脈內皮細胞增殖，并上調VEGF和cyclin A和cyclin D的表達。
　　3.不同雌激素受體配體對二氫睪酮的促人主動脈內皮細胞增殖的影響具有差異性。α雌二醇、染料木黃酮和PPT對二氫睪酮誘導的人主動脈內皮細胞增殖無抑制作用;而β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、氟維司群和DPN抑制了二氫睪酮誘導的