線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換在大鼠肝臟缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、一、背景 缺血再灌注損傷是肝臟外科經(jīng)常面臨的問題。缺血再灌注損傷后，凋亡是細(xì)胞死亡的主要方式之一。線粒體是細(xì)胞凋亡過程中的核心細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡中起最基本的作用。線粒體通過釋放凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和細(xì)胞色素C等促使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵物質(zhì)之一，在凋亡刺激因子的作用下，細(xì)胞色素C由線粒體釋放進(jìn)入胞漿，與凋亡蛋白激活因子(Apaf-1)及前caspase-9結(jié)合形成復(fù)合體，啟動(dòng)凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后激活casp

2、ase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞漿是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵步驟，這一步驟與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrialpermeabilitytransition，MPT)有密切關(guān)系。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，PT孔)開放引起MPT，PT孔是位于線粒體內(nèi)膜，具有高電傳導(dǎo)性的非特異性孔道，正常情況下PT孔間歇性開放，以維持線粒體膜電位和Ca2+

3、平衡。凋亡刺激因子作用下，PT孔持續(xù)性開放，使分子量大于1500Da的分子非選擇性地通過線粒體內(nèi)膜，導(dǎo)致線粒體膜去極化、氧化磷酸化作用解偶聯(lián)、基質(zhì)明顯腫脹等，即發(fā)生MPT，最終導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。PT孔的分子組成中包含環(huán)孢素受體D，環(huán)孢素A可以通過與其受體D特異性結(jié)合來抑制PT孔的開放、MPT、以及其后的細(xì)胞色素C釋放和細(xì)胞凋亡。有關(guān)研究中，環(huán)孢素A是最常被使用的PT孔開放抑制劑，許多研究結(jié)果表明，小劑量環(huán)孢

4、素A對(duì)于心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等缺血再灌注后的MPT以及凋亡具有抑制作用，但涉及肝細(xì)胞的研究還較少。 二、目的 研究肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的機(jī)制，探索緩解缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的措施，對(duì)于臨床治療肝臟缺血再灌注損傷具有重要的意義。本研究觀察大鼠肝臟缺血再灌注后細(xì)胞色素C的釋放、caspases的活化、肝細(xì)胞凋亡，以及環(huán)孢素A對(duì)上述各環(huán)節(jié)的影響，目的為進(jìn)一步闡明再灌注后細(xì)胞凋亡中的MPT機(jī)制以及抑制MPT對(duì)再灌注損傷的

5、緩解作用。它可能為臨床治療肝臟再灌注損傷提供新思路。 三、方法與結(jié)果 1、動(dòng)物模型：參考Nauta的方法建立常溫下大鼠肝臟部分缺血再灌注模型。只阻斷肝門部通向左、中肝葉血管，開放右葉及尾狀葉分支以避免門靜脈淤血，缺血范圍70％。實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠，通過對(duì)30min、60min、90min三個(gè)不同的熱缺血時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，肝組織石蠟切片HE染色見再灌注24h后，30min組及60min組未見明顯肝細(xì)胞壞死，而常溫下90min的缺血

6、時(shí)間使肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯壞死灶。故下一步觀察缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡的大鼠模型選用缺血時(shí)間為60min。 2、實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組，A組為缺血再灌注組(I/R組，n=25)，B組為環(huán)孢素A預(yù)處理組(CsA組，n=25)，C組為假手術(shù)組(n=5)。給藥方法：CsA組大鼠術(shù)前按照10mg/kg/day劑量，將CsA溶于生理鹽水5ml灌胃，每天一次，術(shù)前連續(xù)4天；I/R組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃。術(shù)前12小時(shí)禁食

7、，自由飲水。手術(shù)采用前述常溫下大鼠肝臟70％缺血再灌注模型，缺血時(shí)間60min，假手術(shù)組除不阻斷肝門血管以外，其余操作同其它兩組。I/R組、CsA組分別于再灌注0h、1h、6h、24h、72h五個(gè)時(shí)相點(diǎn)收集肝臟組織及血清標(biāo)本，假手術(shù)組于開腹后60min收集標(biāo)本。 3、檢測指標(biāo)：分別采用免疫組化和WesternBlotting方法檢測胞漿細(xì)胞色素C表達(dá)；免疫組化檢測胞漿活性caspase-3表達(dá)；TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡，光鏡下

8、計(jì)數(shù)凋亡指數(shù)；全自動(dòng)生化儀檢測肝功能指標(biāo)包括ALT、AST、LDH；透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。免疫組化切片采用ImageProPlus4.5圖像分析軟件分析，陽性染色面積以積分光密度值表示。 4、結(jié)果：(1)細(xì)胞色素C及caspase3免疫組化結(jié)果相似：I/R組、CsA組在再灌注0h，1h，6h，24h等時(shí)相點(diǎn)，表達(dá)明顯強(qiáng)于假手術(shù)組，6h最明顯。CsA組與I/R組相比，在再灌注前(Oh)無顯著差異，再灌注后1h，6h，24

9、h顯著低于I/R組，至72h已無明顯陽性表達(dá)。(2)胞漿細(xì)胞色素CWesternBlotting檢測：再灌注前，I/R組和CsA組即有細(xì)胞色素C釋放，此時(shí)兩組之間無顯著差異；再灌注后1h、6h，CsA組細(xì)胞色素C釋放顯著低于I/R組；假手術(shù)組僅有淺淡條帶。(3)肝功能中三項(xiàng)酶學(xué)指標(biāo)變化趨勢相似：I/R組、CsA組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)上均顯著高于假手術(shù)組，CsA組與I/R組相比，在6h、24h時(shí)點(diǎn)指標(biāo)顯著降低。(4)電鏡檢查見缺血再灌注使肝細(xì)胞超微

10、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為線粒體顯著腫脹、空泡化，以再灌注后1h、6h較明顯，CsA組改變程度輕于I/R組。(5)凋亡指數(shù)：再灌注Oh、1h，三組之間無顯著差異；再灌注6h、24h、72h，I/R組、CsA組顯著高于假手術(shù)組，同時(shí)CsA組顯著低于I/R組，凋亡指數(shù)高峰期出現(xiàn)在再灌注6h。 四、結(jié)論 1、缺血再灌注引起大鼠肝細(xì)胞線粒體釋放細(xì)胞色素C、caspase3活化、細(xì)胞凋亡等一系列變化，這一過程可能和MPT相關(guān)。