線粒體膜通透性轉換在大鼠肝臟缺血再灌注后肝細胞凋亡中的作用.pdf

1、一、背景 缺血再灌注損傷是肝臟外科經(jīng)常面臨的問題。缺血再灌注損傷后，凋亡是細胞死亡的主要方式之一。線粒體是細胞凋亡過程中的核心細胞器，在細胞凋亡中起最基本的作用。線粒體通過釋放凋亡誘導因子(AIF)和細胞色素C等促使細胞凋亡。細胞色素C是細胞凋亡中的關鍵物質之一，在凋亡刺激因子的作用下，細胞色素C由線粒體釋放進入胞漿，與凋亡蛋白激活因子(Apaf-1)及前caspase-9結合形成復合體，啟動凋亡蛋白酶級聯(lián)反應，最后激活casp

2、ase-3，導致細胞凋亡。細胞色素C從線粒體釋放入胞漿是細胞凋亡過程中的關鍵步驟，這一步驟與線粒體膜通透性轉換(mitochondrialpermeabilitytransition，MPT)有密切關系。線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，PT孔)開放引起MPT，PT孔是位于線粒體內膜，具有高電傳導性的非特異性孔道，正常情況下PT孔間歇性開放，以維持線粒體膜電位和Ca2+

3、平衡。凋亡刺激因子作用下，PT孔持續(xù)性開放，使分子量大于1500Da的分子非選擇性地通過線粒體內膜，導致線粒體膜去極化、氧化磷酸化作用解偶聯(lián)、基質明顯腫脹等，即發(fā)生MPT，最終導致細胞色素C從線粒體釋放，進一步引起細胞凋亡。PT孔的分子組成中包含環(huán)孢素受體D，環(huán)孢素A可以通過與其受體D特異性結合來抑制PT孔的開放、MPT、以及其后的細胞色素C釋放和細胞凋亡。有關研究中，環(huán)孢素A是最常被使用的PT孔開放抑制劑，許多研究結果表明，小劑量環(huán)孢

4、素A對于心肌細胞、神經(jīng)細胞等缺血再灌注后的MPT以及凋亡具有抑制作用，但涉及肝細胞的研究還較少。 二、目的 研究肝臟缺血再灌注損傷后細胞凋亡的機制，探索緩解缺血再灌注損傷中細胞凋亡的措施，對于臨床治療肝臟缺血再灌注損傷具有重要的意義。本研究觀察大鼠肝臟缺血再灌注后細胞色素C的釋放、caspases的活化、肝細胞凋亡，以及環(huán)孢素A對上述各環(huán)節(jié)的影響，目的為進一步闡明再灌注后細胞凋亡中的MPT機制以及抑制MPT對再灌注損傷的

5、緩解作用。它可能為臨床治療肝臟再灌注損傷提供新思路。 三、方法與結果 1、動物模型：參考Nauta的方法建立常溫下大鼠肝臟部分缺血再灌注模型。只阻斷肝門部通向左、中肝葉血管，開放右葉及尾狀葉分支以避免門靜脈淤血，缺血范圍70％。實驗采用SD大鼠，通過對30min、60min、90min三個不同的熱缺血時間的實驗，肝組織石蠟切片HE染色見再灌注24h后，30min組及60min組未見明顯肝細胞壞死，而常溫下90min的缺血

6、時間使肝細胞出現(xiàn)明顯壞死灶。故下一步觀察缺血再灌注后肝細胞凋亡的大鼠模型選用缺血時間為60min。 2、實驗分組及給藥方法：將實驗大鼠隨機分為三組，A組為缺血再灌注組(I/R組，n=25)，B組為環(huán)孢素A預處理組(CsA組，n=25)，C組為假手術組(n=5)。給藥方法：CsA組大鼠術前按照10mg/kg/day劑量，將CsA溶于生理鹽水5ml灌胃，每天一次，術前連續(xù)4天；I/R組及假手術組給予等量生理鹽水灌胃。術前12小時禁食

7、，自由飲水。手術采用前述常溫下大鼠肝臟70％缺血再灌注模型，缺血時間60min，假手術組除不阻斷肝門血管以外，其余操作同其它兩組。I/R組、CsA組分別于再灌注0h、1h、6h、24h、72h五個時相點收集肝臟組織及血清標本，假手術組于開腹后60min收集標本。 3、檢測指標：分別采用免疫組化和WesternBlotting方法檢測胞漿細胞色素C表達；免疫組化檢測胞漿活性caspase-3表達；TUNEL法檢測肝細胞凋亡，光鏡下

8、計數(shù)凋亡指數(shù)；全自動生化儀檢測肝功能指標包括ALT、AST、LDH；透射電鏡觀察肝細胞超微結構變化。免疫組化切片采用ImageProPlus4.5圖像分析軟件分析，陽性染色面積以積分光密度值表示。 4、結果：(1)細胞色素C及caspase3免疫組化結果相似：I/R組、CsA組在再灌注0h，1h，6h，24h等時相點，表達明顯強于假手術組，6h最明顯。CsA組與I/R組相比，在再灌注前(Oh)無顯著差異，再灌注后1h，6h，24

9、h顯著低于I/R組，至72h已無明顯陽性表達。(2)胞漿細胞色素CWesternBlotting檢測：再灌注前，I/R組和CsA組即有細胞色素C釋放，此時兩組之間無顯著差異；再灌注后1h、6h，CsA組細胞色素C釋放顯著低于I/R組；假手術組僅有淺淡條帶。(3)肝功能中三項酶學指標變化趨勢相似：I/R組、CsA組在各個時點上均顯著高于假手術組，CsA組與I/R組相比，在6h、24h時點指標顯著降低。(4)電鏡檢查見缺血再灌注使肝細胞超微

10、結構發(fā)生變化，表現(xiàn)為線粒體顯著腫脹、空泡化，以再灌注后1h、6h較明顯，CsA組改變程度輕于I/R組。(5)凋亡指數(shù)：再灌注Oh、1h，三組之間無顯著差異；再灌注6h、24h、72h，I/R組、CsA組顯著高于假手術組，同時CsA組顯著低于I/R組，凋亡指數(shù)高峰期出現(xiàn)在再灌注6h。 四、結論 1、缺血再灌注引起大鼠肝細胞線粒體釋放細胞色素C、caspase3活化、細胞凋亡等一系列變化，這一過程可能和MPT相關。