α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分α2-腎上腺素受體在大鼠耳蝸的分布表達(dá)研究
　　 研究目的:α2-腎上腺素受體(α2-adrenergicreceptors，α2-ARs)是腎上腺素受體(adrenergicreceptor，AR)家族的重要組成部分。盡管一些功能性方面的研究，如藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)α2-ARs激動(dòng)劑和拮抗劑間接證實(shí)了α2-ARs在耳蝸存在，但形態(tài)學(xué)方面直接觀察α2-ARs在耳蝸分布表達(dá)狀況的資料目前尚未見(jiàn)報(bào)道。了解α2-ARs在耳蝸分布表

2、達(dá)特征，是進(jìn)一步深入研究其在耳蝸發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。所以本實(shí)驗(yàn)主要從形態(tài)學(xué)角度觀察α2-ARs在初生7天乳大鼠耳蝸的表達(dá)分布規(guī)律。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色來(lái)檢測(cè)α2-ARs的三種亞型:α2a-，α2b-和α2c-AR在初生7天乳大鼠耳蝸的分布表達(dá)情況。為保證觀察結(jié)果更具普遍性，染色的耳蝸切片至少來(lái)源自5只動(dòng)物。α2a-和α2c-AR是多克隆抗體，α2b-AR是單克隆抗體。陽(yáng)性對(duì)照選擇腎臟組織。我們把在腎臟組織切片染

3、色過(guò)程中，摸索出的作用效果較好的一抗?jié)舛?，參考?yīng)用到耳蝸組織切片的染色中。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)α2-ARs在耳蝸的表達(dá)非常廣泛:包括柯蒂氏器，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiralganglionneurons，SGNs)，螺旋韌帶和血管紋均見(jiàn)α2-ARs三種亞型陽(yáng)性表達(dá)。在柯蒂氏器中，毛細(xì)胞，內(nèi)、外溝細(xì)胞和Deiters’細(xì)胞等均存在三種亞型的表達(dá)，其中，毛細(xì)胞的頂部和底部，著色明顯，并且表達(dá)強(qiáng)弱無(wú)太大差異。我們還發(fā)現(xiàn)，α2-AR

4、s在不同亞型之間的細(xì)胞定位不同:α2a-AR主要定位在細(xì)胞核和核周部分，α2b-和2c-AR主要定位于細(xì)胞膜和核周部分。α2-ARs在耳蝸三轉(zhuǎn)分布無(wú)明顯強(qiáng)弱的變化。
　　 研究結(jié)論:α2-ARs在SGNs的表達(dá)，提示其可能影響SGNs的發(fā)育或功能。α2-ARs在柯蒂氏器廣泛表達(dá)提示柯蒂氏器的支持細(xì)胞不僅為毛細(xì)胞提供機(jī)械支持，同時(shí)也可能為毛細(xì)胞提供代謝支持。α2-ARs表達(dá)在血管紋和螺旋韌帶，提示α2-ARs可能參與調(diào)控特殊離子濃

5、度梯度并調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液的產(chǎn)生。α2-ARs在耳蝸的廣泛表達(dá)為研究其在耳蝸的功能奠定了基礎(chǔ)，α2-ARs可能在調(diào)節(jié)耳蝸功能方面發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分溴莫尼定作用于α2-腎上腺素受體保護(hù)SGNs對(duì)抗谷氨酸和H2O2損傷的機(jī)制研究
　　 研究目的:溴莫尼定(brimonidine)，作為高度選擇性α2-腎上腺素受體（α2-adrenergicreceptors，α2-ARs）激動(dòng)劑，對(duì)某些神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果證實(shí)，brimonidine可減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性，并降低由缺血所致的細(xì)胞外升高的谷氨酸濃度;另一方面，brimonidine可完全阻斷活性氧簇的產(chǎn)生，減輕由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，預(yù)防由氧化壓力導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。而我們知道，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiralganglionneurons，SGNs)的興奮性損傷和氧化損傷是許多類型感音神經(jīng)性耳聾的基礎(chǔ)。因此，我們假設(shè)brimonidine對(duì)受損的耳蝸SGNs也有保護(hù)作用。這種假

7、設(shè)的前提條件是SGNs上有α2-ARs存在。但目前仍不明確SGNs上是否有α2-ARs表達(dá)，brimonidine是否對(duì)損傷的SGNs有保護(hù)作用也未見(jiàn)報(bào)道。所以本研究，擬明確α2-ARs在乳大鼠SGNs上的表達(dá)情況，并建立谷氨酸和H2O2損傷體外原代培養(yǎng)的SGNs模型，研究brimonidine對(duì)谷氨酸和H2O2損傷下的SGNs有無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用;如果有保護(hù)作用，我們將繼續(xù)深入研究brimonidine保護(hù)神經(jīng)的具體機(jī)制。這將為感音神經(jīng)性

8、耳聾提供可能的全新的治療方法。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:體外原代培養(yǎng)初生3天乳大鼠SGNs，采用抗-NSE抗體免疫熒光染色法鑒定SGNs后，通過(guò)RT-PCR，Westernblot和免疫熒光染色等方法，明確α2-ARs在SGNs上的表達(dá)，并定位α2-ARs在SGNs上表達(dá)部位。之后建立谷氨酸和H2O2損傷體外原代培養(yǎng)的SGNs模型，進(jìn)一步觀察在brimonidine干預(yù)或不干預(yù)的情況下，谷氨酸和H2O2作用于培養(yǎng)的SGNs的變化，通過(guò)M

9、TT法分別檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。通過(guò)吖啶橙染色和Hoechst33342/PI雙染色法觀察各組細(xì)胞的凋亡和壞死情況。通過(guò)Westernblot法檢測(cè)α2-ARs、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2、iNOS和artemin的表達(dá)變化，從而部分明確brimonidine保護(hù)SGNs的具體機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:SGNs存在α2-ARs三亞型的表達(dá)。α2-ARs的mRNA表達(dá)的趨勢(shì)與其蛋白表達(dá)

10、趨勢(shì)不平行，并且α2-ARs三亞型在SGNs細(xì)胞上的定位是明顯不同的:α2a-受體主要存在于細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)的核周區(qū)域而α2b-和α2c-受體主要定位于核周部分和細(xì)胞膜。細(xì)胞存活率結(jié)果提示:在1mM谷氨酸或300μMH2O2作用下，SGNs細(xì)胞存活率明顯降低。當(dāng)給予谷氨酸干預(yù)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，SGNs的細(xì)胞存活率相比于對(duì)照組降低至76.45±2.76％;當(dāng)給予H2O2時(shí)，細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組降低至62.84±5.16％，即300μM

11、的H2O2所誘發(fā)的SGNs損傷比1mM谷氨酸引起的損傷嚴(yán)重。吖啶橙染色和Hoechst33342/PI雙染均發(fā)現(xiàn)給予1mM谷氨酸或300μMH2O2后SGNs均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)凝聚和凋亡小體等凋亡病理變化。Brimonidine可保護(hù)SGNs，減輕谷氨酸或H2O2所致的損傷，明顯提高SGNs細(xì)胞存活率:當(dāng)加入1μM的brimonidine后，谷氨酸組細(xì)胞存活率升高到92.97±3.43％(P＜0.001)，H2O2組細(xì)胞存活

12、率提高到85.48±5.84％(P＜0.001)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異。同時(shí)，brimonidine可降低由谷氨酸或H2O2誘發(fā)升高的Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2和artemin的蛋白表達(dá)水平(P＜0.005)，并改變Bcl-2和iNOS的表達(dá)(P＜0.005)。上述brimonidine所引起的這些變化和效果均可被育亨賓逆轉(zhuǎn)(P＜0.05)。
　　 研究結(jié)論:我們的研究結(jié)果首次描述了α2-A