超抗原SEA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和無能的體內(nèi)外研究.pdf

1、超抗原是一類強(qiáng)大的免疫激活劑，它無需抗原提呈細(xì)胞的加工處理，而是以完整的蛋白質(zhì)形式結(jié)合于MHC-Ⅱ類分子溝槽外側(cè)，激活大量的T 細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。超抗原的這種高效免疫活性，使其成為一種新的腫瘤免疫治療模式。我們的實(shí)驗(yàn)室多年來一直致力于腫瘤免疫治療的研究，通過克隆SEA 基因，對SEA 進(jìn)行原核表達(dá)、分離純化，制備了活性較高的SEA蛋白；利用納米乳劑為載體包裹腫瘤特異性抗原MAGE-1-HSP70 融合蛋白與SEA 配比制備出一

2、種新型腫瘤納米疫苗，并研究了其理化和生物學(xué)特性以及抗腫瘤免疫效應(yīng)；同時(shí)構(gòu)建了肝癌靶向性SEA/CD80 基因共表達(dá)重組腺病毒載體，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其能有效地激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 但是在進(jìn)一步的研究中人們發(fā)現(xiàn)，超抗原的多次刺激導(dǎo)致了T 細(xì)胞的免疫耐受，即一部分抗原特異性的T 細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，余下的抗原反應(yīng)性T 細(xì)胞對超抗原的再次刺激表現(xiàn)為無反應(yīng)性，即無能。超抗原的這一特性給人們帶來了負(fù)面影響，限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用，

3、因此超抗原的理論和作用機(jī)制的研究又成為熱點(diǎn)。但是要想將超抗原SEA 免疫治療應(yīng)用于臨床，只研究理論機(jī)制是不夠的，超抗原本身的劑量、途徑和使用方法等對體內(nèi)外T 細(xì)胞免疫效應(yīng)的正負(fù)影響及規(guī)律，對于SEA 的臨床實(shí)際應(yīng)用同樣具有重要的指導(dǎo)意義，而這在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)地研究報(bào)道，也是我們研究腫瘤超抗原疫苗的一個(gè)空缺。因此本研究的目的就是通過建立小鼠體內(nèi)和體外無能T細(xì)胞模型，從增殖反應(yīng)、細(xì)胞膜表型變化和細(xì)胞因子的合成與釋放等方面系統(tǒng)全面地探討超抗

4、原SEA 影響T 細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的量效關(guān)系及規(guī)律特點(diǎn)，為超抗原在腫瘤臨床免疫治療中的合理而有效地應(yīng)用提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要概括如下： 1. 超抗原SEA 對小鼠脾淋巴細(xì)胞活化和增值的體內(nèi)外影響 目的: 分別用SEA單次刺激體內(nèi)或體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞，觀察SEA 促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化和增殖的規(guī)律和特點(diǎn)。方法：①采用MTT法測定SEA刺激后脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。②通過FACS 檢測SEA 初次刺激后脾淋巴細(xì)胞膜表

5、型的變化。③用CTLL-2 細(xì)胞測定細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清中IL-2 的活性，并用FACS 檢測細(xì)胞內(nèi)IL-2 的水平。結(jié)果：在體外，使脾淋巴細(xì)胞顯著增殖的SEA 濃度范圍是1-1000ng/ml，選擇100ng/ml 作為觀察SEA 體外刺激能力的最佳劑量，其既能刺激T 細(xì)胞的顯著增殖，又不會(huì)導(dǎo)致過早的細(xì)胞死亡。在體內(nèi)，根據(jù)對T 細(xì)胞刺激程度和效力維持時(shí)間，選擇腹腔注射為最佳注射途徑；SEA 劑量在5-15μg 范圍內(nèi)均能促進(jìn)CD3 表達(dá)

6、顯著上升，最佳劑量為10μg。體內(nèi)外結(jié)果均顯示，SEA 單次刺激促進(jìn)了T 細(xì)胞活化的主要膜表面分子（CD69 和CD25）的表達(dá)顯著升高，使CD4 與CD8 的表達(dá)同步上升，IL-2 的合成和釋放快速增加。結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)的SEA 對體內(nèi)外的T 細(xì)胞均具有強(qiáng)烈的活化和增殖作用，其對CD4 和CD8 亞群具有相同的增殖效果。為下一步研究超抗原誘導(dǎo)T 細(xì)胞無能的實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。 2. 超抗原SEA 誘導(dǎo)T 細(xì)胞無能的體

7、內(nèi)外研究 目的：建立T細(xì)胞無能的小鼠體內(nèi)和體外模型，觀察超抗原SEA反復(fù)刺激誘導(dǎo)無能T細(xì)胞的規(guī)律和特點(diǎn)。 方法：①在體外，用MTT法測定間隔48h多次SEA刺激后的脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)；在體內(nèi)，間隔不同天數(shù)反復(fù)注射SEA后，通過FACS檢測脾淋巴細(xì)胞中CD3 的表達(dá)。②通過FACS分析SEA反復(fù)刺激后，體內(nèi)外淋巴細(xì)胞膜表型CD4、CD8、CD69 和CD25 的變化。③測定細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清中細(xì)胞因子（IL-2、TNF-

8、α、IFN-γ、IL-4 和IL-10、）的水平，及細(xì)胞內(nèi)IL-2 和IL-10 的陽性百分率。④在不同時(shí)間點(diǎn)，SEA再刺激體外或體內(nèi)誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞，通過MTT法的測定觀察其反應(yīng)性的恢復(fù)情況。 結(jié)果：①經(jīng)SEA初次刺激后的體內(nèi)或體外培養(yǎng)的T細(xì)胞，對SEA的再刺激仍顯示有繼續(xù)增殖的能力。在體外，刺激T細(xì)胞第二次增殖的SEA最佳濃度為100ng/ml。與SEA初次刺激相比，細(xì)胞膜表型CD8 表達(dá)上升的幅度顯著高于CD4，CD69

9、的表達(dá)沒有明顯上升，但仍保持在較高的水平；細(xì)胞因子IL-4和IL-10 的含量均顯著升高。在體內(nèi)，間隔不同的天數(shù)，SEA體內(nèi)第二次注射均可引起CD3 表達(dá)升高。間隔3 天組中，SEA的再注射主要促進(jìn)了CD4 表達(dá)的上升；間隔28 天組中CD4 和CD8 的表達(dá)均有上升，且趨勢相近。與SEA初次注射相比，血清及細(xì)胞內(nèi)IL-2 的水平仍有小幅度的遞增，IL-10 水平則顯著上升。體內(nèi)外，連續(xù)兩次SEA刺激均能導(dǎo)致CD25 不同程度的表達(dá)升高

10、。②在體外，T細(xì)胞受間隔48h連續(xù)三次SEA刺激后，無明顯的增殖反應(yīng)；CD4 和CD8 的表達(dá)沒有繼續(xù)上升；CD69 的表達(dá)顯著下降；而CD25 的表達(dá)在末次刺激后48h內(nèi)保持在較高的水平。在體內(nèi)，間隔不同天數(shù)的SEA連續(xù)三次注射后，小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3 的表達(dá)均有不同程度的下降。各組中CD8 的表達(dá)水平基本相似，CD4 和CD25 卻有明顯的不同：間隔3 天組中，CD4 的表達(dá)在末次注射后3 天內(nèi)明顯降低；CD25 沒有上升的趨勢，

11、但在末次注射后3天內(nèi)仍保持一定水平的表達(dá)。間隔28 天組中，CD4 的表達(dá)較穩(wěn)定，沒有顯著的升降；CD25 的表達(dá)水平較低。體內(nèi)外均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SEA多次刺激后，僅IL-10的水平仍繼續(xù)上升。③體外培養(yǎng)的無能T細(xì)胞在7 天內(nèi)幾乎沒有增殖能力，21 天后增殖能力顯著提高，接近正常水平。在體內(nèi)，間隔3 天組和間隔28天組中誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞分別從末次注射后第21 天和第28 天開始出現(xiàn)較弱的應(yīng)答反應(yīng)。 結(jié)論：①首次在C57BL/6 小鼠體

12、內(nèi)外成功建立了無能T細(xì)胞模型。但體內(nèi)外誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間的休息，其應(yīng)答反應(yīng)是可以逐漸恢復(fù)的。②經(jīng)SEA初次刺激的T細(xì)胞，對SEA的再刺激，仍具有潛在的增殖反應(yīng)。在體外，SEA的第二次刺激主要促進(jìn)CD8 亞群的增殖；在體內(nèi)，首次證實(shí)間隔較短時(shí)間的連續(xù)兩次SEA注射主要促進(jìn)了CD4 亞群的增殖，而間隔較長時(shí)間的兩次SEA注射則對CD4 和CD8 亞群產(chǎn)生相似的增殖效果。③在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，首次證實(shí)了注射間隔時(shí)間的長短與無能的觸發(fā)無關(guān)，

13、但影響了CD4 亞群的克隆清除，即間隔時(shí)間越短，被清除的CD4+T細(xì)胞越多；間隔時(shí)間越長，CD4+T細(xì)胞清除的程度越小。④在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管CD25 的高表達(dá)與無能的誘導(dǎo)密切相關(guān)，但不是絕對的，即在CD25 低表達(dá)的情況下也可觸發(fā)T細(xì)胞無能，并且CD25可能不參與無能狀態(tài)的維持。⑤體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)IL-10 水平的升高與誘導(dǎo)T細(xì)胞無能密切相關(guān)，還可能與無能T細(xì)胞的維持有關(guān)。 3.超抗原SEA誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)外T細(xì)胞無能過程中CD

14、28/CTLA-4的變化 目的：在超抗原SEA 誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)外T 細(xì)胞無能的過程中，觀察CD28和CTLA-4 變化規(guī)律及相互關(guān)系。方法：SEA 體內(nèi)或體外單次或多次刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后，通過FACS 檢測細(xì)胞膜表面CD28 和CD152（CTLA-4）陽性表達(dá)率，及胞內(nèi)CTLA-4 的表達(dá)。結(jié)果：體外和體內(nèi)的結(jié)果相似，SEA 初次刺激后，CD28 的表達(dá)顯著上升；而CTLA-4 在胞內(nèi)和膜表面的表達(dá)均低。 SEA再次刺

15、激后，CD28 的表達(dá)繼續(xù)上升；CTLA-4 的表達(dá)明顯增加，胞內(nèi)CTLA-4 的升高尤為顯著。SEA 連續(xù)三次刺激后，CD28的表達(dá)顯著降低；CTLA-4 在膜表面和胞內(nèi)的表達(dá)均開始下降。 結(jié)論：CTLA-4 的負(fù)調(diào)節(jié)作用限制了CD28 的表達(dá)，抑制T 細(xì)胞的繼續(xù)活化，有利于無能的誘導(dǎo)；但CTLA-4在SEA 反復(fù)刺激后的表達(dá)下調(diào)，提示其可能不參與無能T 細(xì)胞的維持。 上述研究顯示，超抗原SEA 誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)是一