STAT3分子的磷酸化及其調控機制在電針預處理腦保護效應中的研究.pdf

1、腦血管病已經成為我國人口的第一位致殘和致死性疾病,并且發(fā)病數量還有逐年增多的趨勢。過去幾年的流行病學研究結果表明,我國每年有160萬~200萬新發(fā)腦卒中的病例,現存的腦血管病患者700余萬人,其中約70％為缺血性腦卒中患者。缺血性腦卒中的損傷危害極大,能夠引起嚴重的神經功能障礙,降低中患者的生活質量,病情嚴重的可危及生命。盡管已證實組織型纖維蛋白酶原激活劑(rtPA)能夠作為一種有效的藥物治療缺血性腦卒中疾病,但有效治療時間窗短(3.5

2、h以內),對治療對象要求高的缺點,使其在臨床治療工作中運用受限(少于3%)。研究腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展機制,尋找有效的預防及治療手段一直是神經科學研究的前沿性、熱點性課題。近年來已證實多種非缺血的預處理方法都能夠改善腦缺血再灌注損傷,我們科研究發(fā)現電針預處理能夠減輕腦缺血再灌注對神經功能的損害,改善神經功能,誘導腦缺血耐受。新近的研究結果證實電針預處理可能通過內源性大麻素系統(tǒng)及其相關信號蛋白發(fā)揮神經保護作用,但其確切機制仍需進一步闡

3、明。信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)在細胞生存和增殖調節(jié)過程中發(fā)揮十分重要的作用,細胞的損傷能夠激活STAT3,使其發(fā)生磷酸化。實驗中證實磷酸化的STAT3分子能夠有效發(fā)揮神經保護作用,但該因子是否在電針誘導的腦缺血耐受保護效應中發(fā)揮作用仍不清楚,本研究以大鼠腦中動脈阻閉(MiddleCerebralArteryOcclusion,MCAO)為腦缺血再灌注損傷模型,觀察電針預處理后大鼠腦缺血再灌注損傷過程中磷酸化STAT3分子的表

4、達及其神經保護作用,并初步探討其在電針預處理腦保護效應中的調節(jié)機制。
　　實驗一
　　電針預處理腦保護作用及電針預處理對缺血后磷酸化STAT3分子表達的影響
　　方法
　　1.電針預處理對腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　清潔級雄性SD大鼠24只(280-320g),隨機分為3組:假手術組(Sham)、單純缺血再灌注組(MCAO)和電針預處理組(EA)。動物經歷2h缺血后于再灌注72h處死,通過腦梗死容積和神

5、經行為學評分的測定觀察電針預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。
　　2.電針預處理腦缺血再灌注損傷后磷酸化STAT3分子的表達(pSTAT3)
　　雄性SD大鼠24只,分組同1。缺血2h后分別于再灌注6h和24h處死,進行蛋白免疫印跡(Westernblotting),檢測再灌注損傷后pSTAT3表達情況。
　　3.電針預處理腦缺血再灌注損傷后活化STAT3表達的定位
　　雄性SD大鼠12只,分組同1。缺血2

6、h再灌注6h后將動物處死,制作冰凍切片,通過免疫熒光雙標染色對目的蛋白進行定位。
　　實驗二
　　磷酸化STAT3分子參與電針預處理誘導的腦缺血耐受
　　方法
　　1.STAT3分子活化抑制劑PpYLKTK對pSTAT3表達的影響
　　雄性SD大鼠12只,隨機分為3組:Sham組、EA+PBS組和EA+Pp組。缺血2h再灌注6h處死進行蛋白免疫印跡(Westernblotting),檢測再灌注損傷后pSTA

7、T3表達情況。
　　2.STAT3分子活化對電針預處理腦保護效應的影響
　　雄性SD大鼠32只,隨機分為4組:Sham組、MCAO組、EA+PBS組和EA+Pp組。動物經歷2h缺血后于再灌注72h處死,通過腦梗死容積和神經行為學評分的測定觀察STAT3分子活化同電針預處理腦保護效應之間的關系。
　　實驗三
　　磷酸化STAT3分子對神經細胞凋亡的影響
　　方法
　　1.STAT3分子活化對電針預處理保

8、護效應中神經細胞凋亡的影響
　　雄性SD大鼠16只,隨機分成4組:Sham組、MCAO組、EA+PBS組和EA+Pp組,缺血2h再灌注24h后將動物處死,進行TUNEL和caspase3陽性細胞染色計數,觀察STAT3分子活化對電針預處理腦保護效應中凋亡細胞數量的影響。
　　2.STAT3分子活化在電針預處理保護效應中凋亡蛋白表達的影響
　　雄性SD大鼠16只,分組同1,缺血2h再灌注24h后將動物處死,進行蛋白免疫印

9、跡(Westernblotting),檢測STAT3分子活化對電針預處理腦保護效應中凋亡蛋白表達的影響。
　　實驗四
　　電針預處理誘導腦保護效應中STAT3分子磷酸化的調控機制
　　方法
　　1.CB1受體拮抗劑AM251及干涉RNA對電針預處理后活化STAT3分子表達的影響
　　雄性SD大鼠32只,隨機分為8組:其中MCAO組、EA組、EA+AM251組以及EA+vehicle組用于觀察AM251參與電

10、針預處理后對pSTAT3(Ser727)表達的影響,另外MCAO組、EA組、EA+CB1-siRNA組以及EA+control-siRNA組用于觀察干涉RNA參與電針預處理后對pSTAT3(Ser727)表達的影響。缺血2h再灌注6h處死進行Westernblotting,檢測再灌注損傷后pSTAT3表達情況。
　　2.CB1受體激動劑WIN55,212-2和ACEA對電針與處理后活化STAT3分子表達的影響
　　雄性SD大

11、鼠24只,隨機分為6組:其中MCAO組、MCAO+WIN組、MCAO+vehicle組用于觀察WIN55,212-2對pSTAT3(Ser727)表達的影響,另外MCAO組、MCAO+ACEA組、MCAO+vehicle組用于觀察ACEA對pSTAT3(Ser727)表達的影響。缺血2h再灌注6h處死進行Westernblotting,檢測再灌注損傷后pSTAT3表達情況。
　　結果
　　1.電針預處理后腦缺血再灌注損傷的變

12、化及對STAT3分子磷酸化水平的影響
　　EA組大鼠的NDS評分明顯優(yōu)于MCAO組(P<0.01),并且EA組大鼠腦梗死容積顯著降低,優(yōu)于MCAO組(P<0.001)。
　　缺血2h再灌注6h后EA組較MCAO組和Sham組pSTAT3(Ser727)表達量顯著升高(P<0.001)。再灌注24h后EA組和MCAO組中pSTAT3(Ser727)表達量較Sham組顯著升高(P<0.05),但EA組和MCAO組之間沒有統(tǒng)計學差

13、異。
　　免疫熒光雙標染色結果顯示,缺血再灌注損傷后pSTAT3(Ser727)主要表達于NeuN陽性的神經元內,胞漿和胞核內都有表達。
　　2.STAT3活化抑制劑PpYLKTK對電針預處理腦保護效應的影響
　　電針后1.5h給予STAT3活化抑制劑PpYLKTK可以顯著下調EA組大鼠缺血再灌注6h后pSTAT3(Ser727)的表達水平(P<0.001)。
　　PpYLKTK可以部分逆轉電針預處理的腦保護效應

14、,缺血2h,再灌注72h后,EA組神經行為學評分顯著優(yōu)于MCAO組以及EA+Pp組(P<0.001),并且腦梗死容積也顯著小于MCAO組以及EA+Pp組(P<0.001)。
　　3.STAT3磷酸化水平的變化對缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的影響
　　PpYLKTK能夠增加缺血腦組織中神經細胞的凋亡數量,缺血2h,再灌注24h后,EA組大鼠腦缺血再灌注損傷組織中Tunel染色陽性細胞數顯著低于EA+Pp組和MCAO組(P<0.

15、01),同時active-caspase-3陽性細胞數也低于EA+Pp組和MCAO組(P<0.05)。
　　缺血2h,再灌注24h后,MCAO組大鼠BAX/Bcl-2比值較Sham組顯著升高,電針組較MCAO組明顯降低,而EA+Pp組較EA組則明顯上調Bax/Bcl-2比值。
　　4.電針預處理腦保護效應中對下游STAT3分子磷酸化的調控機制
　　缺血2h再灌注6h后EA+CB1-siRNA和EA+AM251組pSTA

16、T3(Ser727)表達量較EA和EA+vehicle組降低(P<0.001)。
　　缺血2h再灌注6h后WIN55,212-2組和ACEA組pSTAT3(Ser727)表達量較MCAO組和MCAO+vehicle組顯著升高(P<0.01)。
　　結論
　　電針預處理通過中樞神經系統(tǒng)內源性大麻素受體CB1調節(jié)下游STAT3分子的磷酸化水平介導缺血再灌注損傷后的神經保護作用,改善腦缺血再灌注損傷的愈后,本實驗進一步闡明了