STAT3在CTGF調(diào)控人牙髓細胞分化中作用的研究.pdf

1、炎癥、外傷等造成的牙髓損傷逐年增多，而現(xiàn)有的臨床治療方法還不能完全再造牙髓或代替牙髓組織的功能。牙髓細胞(Human Dental PlupCells，hDPCs)是一種具有一定的自我增殖和分化潛力的細胞。以往研究已證實體外培養(yǎng)的牙髓細胞有形成鈣化組織的能力，這種能力依賴于有多種生物學效應的細胞因子的調(diào)控，即細胞因子能夠不同程度的刺激受損的牙髓細胞再生。結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，C

2、TGF)具有強烈促纖維化的作用，它可以增強牙髓細胞的礦化能力，但不能刺激牙髓細胞增殖，其中作用的分子機制尚不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶-信號轉導子和轉錄激活子(Janus protein tyrosine kinase-Signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT)通路與炎癥反應、細胞增殖、分化等相關。本研究即探討STAT3是否在CTGF刺激牙髓細胞增殖分化過程中起

3、重要作用。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 CTGF在人牙髓細胞增殖、分化過程中的作用
　　目的:體外培養(yǎng)hDPCs，觀察CTGF對hDPCs增殖、分化的影響。
　　方法:選取由于正畸或阻生拔除的健康、完整的第三磨牙（均經(jīng)患者知情同意），在無菌條件下取出牙髓組織，采用組織酶消化法原代培養(yǎng)hDPCs并鑒定來源。采用不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）的CTGF作用于hDPC

4、s，作用不同時間后，通過甲基噻唑基四唑(MethylThiazolyl Tetrazolium，MTT)檢測CTGF對hDPCs增殖的影響;茜素紅染色觀察礦化結節(jié)的形成。
　　結果:
　　1.組織塊酶解法能成功培養(yǎng)出成纖維樣細胞，倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)均一，為典型的梭形，胞體豐滿，胞漿豐富，細胞核呈圓形或卵圓形位于細胞中央，核仁清晰可見。免疫細胞化學染色結果示波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。
　　2.MTT結果顯

5、示CTGF三個濃度（10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）均對細胞無毒性作用，能促進hDPCs增殖，且隨著時間延長作用效果增強，第1天，實驗組與對照組沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05），從第3天開始，實驗組與對照組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;茜素紅結果顯示CTGF組的礦化結節(jié)明顯高于對照組。
　　結論:組織塊酶解法能成功分離和培養(yǎng)出hDPCs;一定濃度的CTGF能夠促進牙髓細胞增殖和分化。
　　第二部分 CTGF對人

6、牙髓細胞中STAT3蛋白表達的影響
　　目的:觀察CTGF作用hDPCs后，細胞中STAT3蛋白的表達情況。
　　方法:取第四代hDPCs制成細胞懸液，爬片后隨機分為對照組、CTGF處理組、Stattic（STAT3特異性抑制劑）+CTGF處理組，分別培養(yǎng)30min后采用免疫組化SABC法檢測中STAT3活性蛋白（磷酸化蛋白，Phos-STAT3）的表達情況。
　　結果:hDPCs培養(yǎng)30 min后，CTGF處理組可見

7、棕色顆粒主要分布在細胞核中，即Phos-STAT3主要在細胞核中表達;對照組相反，棕色顆粒主要分布在細胞質(zhì)中，Phos-STAT3在胞質(zhì)中表達，細胞核中無表達;Stattic+CTGF處理組細胞質(zhì)中棕色顆粒比對照組明顯減少，細胞核中無棕色顆粒，Phos-STAT3在細胞質(zhì)中表達，但表達量比對照組降低。
　　結論:CTGF能明顯促進STAT3磷酸蛋白的表達，并誘導Phos-STAT3轉移細胞核中表達;Stattic能抑制STAT3蛋

8、白磷酸化。
　　第三部分 STAT3在CTGF誘導牙髓細胞分化中的作用
　　目的:Stattic與CTGF聯(lián)合作用hDPCs后，觀察礦化結節(jié)以及ALP、OCN、OPN和DMP-1 mRNA表達水平。
　　方法:取第4代人牙髓細胞制成細胞懸液，以104個/ml的濃度接種在6孔板和50 ml培養(yǎng)瓶中，細胞匯合后，將hDPCs隨機分為空白對照組、陽性對照組（20ng/ml的CTGF）和實驗組（STAT3抑制劑Stattic作

9、用半小時后加入20ng/ml的CTGF），作用7d、14d、28 d后，采用茜素紅染色觀察礦化結節(jié)的形成，Real-time PCR法檢ALP、OCN、OPN和DMP-1的mRNA表達水平。
　　結果:茜素紅結果:與陽性對照組相比，加入Stattic后，礦化結節(jié)形成明顯減少。
　　PCR結果顯示:7天時，加入Stattic后，ALP、OCN、OPN和DMP-1的mRNA表達下降，CTGF組表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.

10、05）;14天時，加入Stattic后，ALP mRNA表達下降，CTGF組表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Stattic組與對照組OCN mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，CTGF組的OCN mRNA表達增高，與其他兩組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Stattic組與對照組OPN mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，CTGF組的OPN mRNA表達降低，較其他兩組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;DMP-1