miR-421下調(diào)FOXO4促進鼻咽癌細胞增殖及凋亡抵抗.pdf

1、microRNA是最近研究發(fā)現(xiàn)的一類長度約為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，其通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)互補配對結(jié)合的方法，從而調(diào)控內(nèi)源基因的表達。miRNA作為生物體生長發(fā)育的重要調(diào)控基因，目前其主要研究方向是探明miRNAs與疾病的關(guān)系，尤其是miRNA與腫瘤的關(guān)系。鼻咽癌(NPC)是廣東地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，在頭頸部惡性腫瘤中占首位。鼻咽癌的發(fā)病人群以40～50歲的青壯年多見，一旦發(fā)病對社會、經(jīng)濟和家庭造成較大影響

2、。鼻咽癌原發(fā)部位隱蔽，不易觀察，且與鼻腔、鼻竇和顱內(nèi)相毗鄰，所以臨床癥狀出現(xiàn)較晚而且各異;鼻咽癌也是頭頸腫瘤中轉(zhuǎn)移率最高的。這些都導(dǎo)致了鼻咽癌常常容易被誤診或漏診，影響治療效果。因此，鼻咽癌的早期診斷和治療的研究一直是我國頭頸外科學(xué)研究的重點之一。目前鼻咽癌的治療還是以放射治療為主。對放療不敏感、放療后復(fù)發(fā)以及中晚期的患者，可采取化學(xué)藥物治療，但這只是輔助性治療或姑息性治療。鼻咽癌的手術(shù)治療也只在一些特殊情況下作為輔助方法采用。除了以上

3、三種常規(guī)治療，近年來也有作者嘗試應(yīng)用光動力療法和微波熱療治療鼻咽癌，但也只能作為輔助手段。重組DNA技術(shù)的發(fā)展使腫瘤的基因治療成為可能。根據(jù)腫瘤發(fā)生機理制定的基因治療方案已成為腫瘤治療的熱點。早期研究者主要運用反義核酸技術(shù)干預(yù)腫瘤相關(guān)基因的表達，取得了一定效果。近年來，RNA干擾技術(shù)在哺乳動物體內(nèi)的應(yīng)用，更為腫瘤的基因治療開辟了一個新的視野。因此，意在探索性地研究miRNA在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用。
　　 通過Targets

4、can數(shù)據(jù)庫，對差異表達miRNA的靶基因進行預(yù)測，并將預(yù)測結(jié)果輸入GenMAPP軟件進行生物學(xué)通路分析。在通路分析中，大部分靶基因富集度高的通路都涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及與癌癥發(fā)生相關(guān)的通路，例如EGFR-1信號通路，MAPK信號通路等等。其中，小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為顯著。同時，Wnt信號通路的顯著性，則與我們實驗室過去在鼻咽癌cDNA表達譜的研究結(jié)果相吻合。繼續(xù)深入研究這些差異miRNA在生物學(xué)通路中的調(diào)控作用，以及尋找與鼻咽癌發(fā)

5、生發(fā)展進程相關(guān)的臨床診斷標(biāo)記物，則是未來努力的方向。
　　 microRNA(miRNA)即微小RNA，是一種存在于植物和動物基因組里的小分子RNA，約19～25nt（少數(shù)小于20nt），由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)、長度為70～80nt的單鏈RNA前體(Pre-miRNA)剪切后形成。它通過與其目標(biāo)mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域（3'-untranslatedregion，3'UTR）完全或非完全互補匹配、參與基因轉(zhuǎn)錄后水平（蛋白表達

6、）的調(diào)控，在生物體內(nèi)各種生理和病理狀態(tài)都發(fā)揮著十分重要的作用。
　　 miRNA最早由Lee等在1993年對線蟲(Caenothabditis elegans)胚胎發(fā)育研究過程中發(fā)現(xiàn)的一種具有調(diào)控功能的非編碼RNA。首先，miRNA基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)在細胞核中被RNaseⅢ Drosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)。在最初的剪切后，Pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白exPortin-5的作用下、由

7、核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中，然后由另一種RNaseⅢ Dicer進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC(RNA-inducedsileneing complex)復(fù)合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。
　　 microRNAs具有重要的組織特異功能，在基因表達中發(fā)揮著總體調(diào)控作用，其中miR-421在腫瘤進展調(diào)控，細胞增殖等方面起著重要的作用，目前對于鼻咽癌的調(diào)控作用尚缺少文獻報道。本課題將

8、探討miR-421在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究的目的是模擬天然miRNA構(gòu)建表達miRNA前體的質(zhì)粒，實現(xiàn)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因miR-421的表達，開展對鼻咽癌的基因治療研究。
　　 首先是調(diào)控目標(biāo)基因的miR-421表達質(zhì)粒的構(gòu)建和有效質(zhì)粒篩選。然后進一步確定針對FOXO4基因的miRNA的有效作用位點，觀察構(gòu)建的質(zhì)粒對鼻咽癌中兩個靶基因的調(diào)控效應(yīng)，為后續(xù)的體外實驗奠定基礎(chǔ)。miRNA重組質(zhì)粒調(diào)控FOXO4表達能有效抑制腫瘤生

9、長，為進一步的臨床研究打下了基礎(chǔ)。
　　 第一部分
　　 1、過表達miR-421促進鼻咽癌細胞增殖和抗凋亡的作用
　　 目的:檢測過表達miR-421對于鼻咽癌細胞增殖和抗凋亡的能力。
　　 方法:利用慢病毒感染技術(shù)，將miR-421轉(zhuǎn)染到CNE2，觀察體外miR-421對CNE2增殖作用，并利用Annexin V法及TUNEL檢測細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:軟瓊脂克隆形成實驗表明，miR-42

10、1過表達細胞的增殖速度是對照組的3倍，表明miR-421上調(diào)可以顯著增強鼻咽癌細胞的生長。此外，Annexin V法及TUNEL檢測表明，miR-421的過表達可增強鼻咽癌細胞對于化療藥物順鉑的凋亡抵抗能力。這些結(jié)果表明，體外實驗中，miR-421在鼻咽癌中扮演著調(diào)控細胞基因的作用。
　　 結(jié)論:miR-421上調(diào)可促進人鼻咽癌細胞的增殖，提高細胞凋亡抵抗能力。
　　 2、抑制miR-421減少鼻咽癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋

11、亡的作用
　　 目的:檢測抑制miR-421對于鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法:利用慢病毒感染技術(shù)，將抑制miR-421轉(zhuǎn)染CNE2，觀察體外miR-421對CNE2增殖作用，并利用Annexin V法及TUNEL檢測細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:軟瓊脂克隆形成實驗表明，抑制miR-421后細胞的增殖速度降低，對照組是抑制組的3倍，表明抑制miR-421可以顯著降低鼻咽癌細胞的生長。此外，Annexin

12、V法及TUNEL檢測表明，抑制miR-421可增強鼻咽癌細胞對于化療藥物順鉑的凋亡促進能力。這些結(jié)果表明，體外實驗中，miR-421在鼻咽癌中扮演著調(diào)控細胞基因的作用。
　　 結(jié)論:抑制miR-421可降低人鼻咽癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。
　　 第二部分
　　 1、探討miR-421對FOXO4信號途徑的作用
　　 目的:研究miR-421促進鼻咽癌細胞增殖及抗凋亡的內(nèi)在分子機制是否通過FOXO4信號途

13、徑調(diào)節(jié)。
　　 方法:構(gòu)建針對耙基因FOXO4的熒光素酶報告基因載體，利用熒光照度計分別測定正常組、miR-421過表達組與miR-421抑制組的熒光值。并利用實時定量PCR及western blot檢測FOXO4靶基因p21，p27，Bim和FasL的mRNA及蛋白表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.在熒光素酶活性檢測中，F(xiàn)OXO4的熒光素酶活性在miR-421過表達的細胞中降低，而在miR-421抑制的細胞中

14、表達增多。2.與此相一致的是，在正常組、miR-421過表達組與miR-421抑制組中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO4四個經(jīng)典靶點基因p21，p27，Bim和FasL的mRNA及蛋白表達在miR-421過表達組是下調(diào)，而在miR-421抑制的細胞中，上述基因及蛋白上調(diào)。
　　 結(jié)論:通過構(gòu)建熒光素酶以及過表達和抑制miR-421實驗結(jié)果表明，miR-421可抑制FOXO4信號通路。
　　 2、miR-421與FOXO4調(diào)控關(guān)系探討

15、>　　 目的:探尋miR-421在基因調(diào)控中針對耙基因FOXO4調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:使用TargetScan軟件工具mir-421目標(biāo)預(yù)測分析表明，F(xiàn)OXO4是mir-421潛在目標(biāo)，利用免疫印跡分析表明，在正常組、miR-421過表達組與miR-421抑制組中基因FOXO4的表達存在顯著的差異性，過表達組蛋白表達低于正常組，而抑制組蛋白表達高于正常組。
　　 為了進一步驗證miR-421與FOXO4相互控制存在的

16、關(guān)系，克隆了FOXO43'UTR片段，含有miR-421結(jié)合位點的psiCHECK-2熒光素酶載體，同時我們克隆了FOXO43'UTR突變載體，具體突變了二個堿基。
　　 通過熒光素酶活性檢測表明，miR-421過表達組低于正常組，而miR-421抑制組高于正常組。
　　 另外，為了進一步分析miR-421與FOXO4在凋亡中的相互作用，在抑制miR-421的時，同時抑制FOXO4作對照，實驗說明，抑制FOXO4基因后，

17、細胞凋亡低于單純抑制miR-421組。
　　 結(jié)果:
　　 1、miR-421過表達與miR-421抑制組中，基因FOXO4表達存在差異性;2、熒光素酶檢測表明，miR-421過表達與miR-421抑制組中熒光值存在差異性，而在突變體卻無此差異性;3、同時抑制miR-421時，選擇下調(diào)基因FOXO4，結(jié)果表明，凋亡細胞低于單純抑制miR-421組。
　　 結(jié)論:基因FOXO4是miR-421調(diào)控目的基因。

18、　　 3、FOXO4是細胞生長和抗凋亡的關(guān)鍵基因目的:探尋FOXO4在細胞生長和抗凋亡的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:為了進一步分析miR-421與FOXO4在凋亡中的作用，我們選擇將miR-421抑制時，然后再單純抑制基因FOXO4來對照，檢測數(shù)據(jù)顯示，在同時抑制miR-421時，單純抑制FOXO4后細胞凋亡數(shù)減少。
　　 結(jié)果:同時抑制miR-421時，選擇下調(diào)基因FOXO4，結(jié)果表明，凋亡細胞低于單純抑制miR-421

19、組。
　　 結(jié)論:FOXO4是細胞生長和抗凋亡的關(guān)鍵基因。
　　 4、在鼻咽癌組織中miR-421與FOXO4的臨床相關(guān)性
　　 目的:研究臨床鼻咽癌患者的腫瘤標(biāo)本中miR-421與FOXO4的關(guān)系。
　　 方法:7例新鮮收集的人鼻咽癌樣本組織，利用QPCR技術(shù)檢測miR-421與FOXO4的表達量，同時采用免疫印跡法檢測FOXO4表達水平，并研究兩者之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:在7例新鮮收集的鼻咽