三氯異氰尿酸對(duì)SD大鼠睪丸結(jié)構(gòu)和功能的影響.pdf

1、隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，迄今為止已有大約10萬種化學(xué)品進(jìn)入人類的日常生活。人們?cè)谏a(chǎn)和生活中接觸的許多種化學(xué)品都會(huì)影響人類的生殖功能，使人類的生育能力特別是精子的質(zhì)量和數(shù)量發(fā)生顯著改變。外來化學(xué)品所造成的生殖損傷日益受到人們的重視。
　　三氯異氰尿酸（Trichloroisocyanuric acid，TCCA）是一種新型、高效、廣譜、低毒、性質(zhì)穩(wěn)定、效力持久、使用方便的消毒劑、漂白劑和防腐劑，廣泛應(yīng)用于飲食、醫(yī)療、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、

2、紡織、造紙等行業(yè)。國(guó)內(nèi)外對(duì)TCCA的相關(guān)研究報(bào)道較少，僅有少量關(guān)于TCCA對(duì)單種生物的毒性研究，而其對(duì)人類生育能力的危害性尚未見到文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究以SPF級(jí)別SD大鼠為研究對(duì)象，通過TCCA較低劑量(0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1)經(jīng)口喂飼24月、較高劑量（96.5、193mg/kg）灌胃染毒10天和高劑量（275、550mg/kg）灌胃染毒10周三個(gè)實(shí)驗(yàn)，觀察TCCA對(duì)雄性SD大鼠睪丸結(jié)構(gòu)及功能的影響，

3、明確TCCA對(duì)雄性SD大鼠生殖系統(tǒng)的損傷，從而確定TCCA的生殖毒性；采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)睪丸內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax、Caspase-3、FasL/Fas蛋白的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)睪丸內(nèi)Bcl-2 mRNA和Fas mRNA的表達(dá)水平；采用原子吸收光譜法檢測(cè)睪丸內(nèi)鋅、鈣、銅的含量。通過這一系列的檢測(cè)，較為深入的研究TCCA對(duì)SD大鼠睪丸毒性效應(yīng)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡述TCCA的毒性作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4、r>　　本研究的主要方法和結(jié)果：
　　1.TCCA對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響：在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑量水平下連續(xù)染毒24個(gè)月，大鼠的一般狀況與對(duì)照組相比均未見明顯不同。在96.5、193mg/kg劑量水平下，染毒4天后大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，喜弓背行走，精神低靡的現(xiàn)象，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)大鼠的死亡。在275、550mg/kg劑量水平下，大鼠染毒后立即表現(xiàn)得比較煩躁，對(duì)外反應(yīng)敏感，背部向上呈彎弓狀，活動(dòng)明顯加強(qiáng)

5、，好打斗；染毒4小時(shí)后大鼠活動(dòng)明顯減少，反應(yīng)遲鈍。染毒5周后，大鼠整日活動(dòng)少或無活動(dòng)，多以臥位為主，行動(dòng)遲緩，進(jìn)食量明顯減少，毛發(fā)無光澤。染毒第9天開始出現(xiàn)大鼠的死亡，死亡大鼠肛周、唇部有血性分泌物。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：SD大鼠的一般狀況（行為活動(dòng)、飲食、生存、異常表現(xiàn)）隨染毒劑量水平的高低明顯不同。染毒劑量越高，毒性反應(yīng)越明顯，大鼠死亡出現(xiàn)的時(shí)間也越早。
　　2.TCCA對(duì)大鼠體重、生殖器官重量的影響
　　在0.

6、71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑量水平下連續(xù)染毒24個(gè)月，TCCA對(duì)各劑量組雄性 SD大鼠的生長(zhǎng)體重?zé)o明顯影響，而對(duì)睪丸重量、睪丸臟器系數(shù)有明顯影響。各劑量組的睪丸重量分別為3.009±1.206g、3.175±1.281g、3.232±1.800g，均低于對(duì)照組睪丸重量4.828±0.799g（P﹤0.001）。各個(gè)劑量組睪丸臟器系數(shù)分別為2.144±0.855、2.326±0.862、2.342±1.225，均低于對(duì)

7、照組睪丸臟器系數(shù)3.603±0.462（P﹤0.001）。在96.5、193mg/kg劑量水平下，4和12周齡大鼠的體重增長(zhǎng)均受到抑制；193mg/kg劑量水平下，4周齡大鼠睪丸重量（1.15±0.25g）和睪丸臟器系數(shù)（7.47±0.98）均低于對(duì)照組睪丸睪丸重量1.44±0.12g和睪丸臟器系數(shù)8.58±0.78（P﹤0.05）。在275、550mg/kg劑量水平下，TCCA可明顯抑制大鼠體重，大鼠睪丸重量分別為3.40±0.44g

8、、3.29±1.07g，均低于對(duì)照組睪丸重量3.58±0.62g（P﹤0.05）。
　　以上結(jié)果提示：隨著 TCCA染毒水平的增加，其對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用，染毒水平越高，體重抑制現(xiàn)象越明顯；長(zhǎng)期接觸較低濃度的TCCA或短期接觸較高濃度的TCCA，均可降低睪丸重量，染毒水平越高，睪丸的重量減輕越明顯。
　　3.TCCA對(duì)睪丸曲細(xì)精管直徑的影響
　　在7.59mg·kg-1·d-1劑量水平下連續(xù)染毒12個(gè)月，SD雄性

9、大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑為193.69±36.9μm，明顯低于對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑239.89±42.1μm（P<0.001）。在96.5、193mg/kg劑量水平下，4周齡大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑分別為167.30±12.55、144.23±11.35μm，明顯低于對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑183.82±20.36μm（P<0.01）；12周齡大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑分別為327.9±30.3、325.9±40.9μm，明顯低于對(duì)照組大鼠睪

10、丸曲細(xì)精管直徑338.2±54.5μm（P<0.01）。
　　以上結(jié)果提示：在一定劑量水平下，TCCA可使大鼠睪丸曲細(xì)精管變得細(xì)小，染毒水平越高，曲細(xì)精管越細(xì)小。
　　4. TCCA對(duì)大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響
　　在7.59mg·kg-1·d-1劑量組連續(xù)染毒12個(gè)月時(shí)，大鼠睪丸出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮、睪丸體積減小、精子彌漫性生成障礙等病變，對(duì)照組睪丸未檢及以上病變。在0、0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑

11、量水平下染毒24個(gè)月時(shí)，各個(gè)劑量組各60例大鼠中，精子生成障礙分別為9、16、24、31例，曲細(xì)精管萎縮分別為12、16、23、32例，睪丸體積減小分別為8、15、20、31例，附睪腔內(nèi)無精子分別為6、13、17、32；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑量組上述病理改變發(fā)生率均明顯增高（P﹤0.001），說明在2.29、7.59 mg·kg-1·d-1的劑量水平下，長(zhǎng)期攝食TCCA會(huì)明顯損傷大鼠睪丸的結(jié)構(gòu)，影響精子形

12、成，從而累及附睪內(nèi)無精子，提示TCCA對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)表現(xiàn)出較為明顯的毒性作用，主要的靶器官為睪丸。
　　在96.5、193mg/kg劑量水平下連續(xù)染毒10天，4周齡大鼠睪丸出現(xiàn)生精細(xì)胞退化（生精細(xì)胞核固縮）增加的現(xiàn)象，12周齡大鼠睪丸出現(xiàn)部分曲細(xì)精管生殖細(xì)胞層次紊亂、生精細(xì)胞脫落、支持細(xì)胞核空泡化、長(zhǎng)形精子細(xì)胞退化等病理改變，且染毒水平越高，病理改變?cè)矫黠@。
　　在275、550mg/kg劑量水平下連續(xù)間隔染毒10周，大

13、鼠睪丸出現(xiàn)曲細(xì)精管的局灶性、彌漫性萎縮以及個(gè)別曲細(xì)精管管腔不規(guī)則、支持細(xì)胞胞漿空泡化及間質(zhì)細(xì)胞增生等病理改變，且染毒水平越高，病理改變?cè)矫黠@。
　　在193mg/kg劑量水平下連續(xù)染毒10天，TCCA可引起4、12周齡大鼠睪丸精原細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)的改變，具體表現(xiàn)為：核膜的破損、核變形、染色質(zhì)濃染等，但精原細(xì)胞未見明顯的凋亡小體和壞死，也未見到其他細(xì)胞器在超微結(jié)構(gòu)上的明顯改變。
　　5. TCCA對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的

14、影響
　　在275mg/kg劑量水平下，連續(xù)10周間隔染毒TCCA，采用免疫組織化學(xué)的SABC方法檢測(cè)SD大鼠睪丸中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果如下：Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)對(duì)照組為67.97％，275mg/kg劑量組為48.75%，Bcl-2表達(dá)降低（P<0.001）；Bax陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)對(duì)照組為58.99%，275mg/kg劑量組為45.70%，Bax表達(dá)降低（P<0.001

15、）；對(duì)照組睪丸曲細(xì)精管Bcl-2/Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)的比值為1.15，275mg/kg劑量組Bcl-2/Bax比值為1.06，二者比值降低（P<0.05）；Fas陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)對(duì)照組為82.31%，275mg/kg劑量組為78.46%，F(xiàn)as表達(dá)指數(shù)無明顯差異，但275mg/kg劑量組Fas表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；FasL陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)對(duì)照組為53.79%，275mg/kg劑量組為76.05%，F(xiàn)asL表達(dá)增加（P<0.001）；Caspase-

16、3陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)對(duì)照組為50.81%，275mg/kg劑量組為57.83%，Caspase-3表達(dá)降低（P<0.05）。
　　在275mg/kg劑量水平下，連續(xù)10周間隔染毒TCCA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)睪丸內(nèi)Bcl-2和Fas mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)數(shù)為0.062±0.015，275mg/kg劑量組相對(duì)表達(dá)數(shù)0.192±0.053，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）

17、；對(duì)照組Fas mRNA相對(duì)表達(dá)數(shù)為0.072±0.005，275mg/kg劑量組相對(duì)表達(dá)數(shù)0.090±0.012，F(xiàn)as mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。
　　本次研究表明，TCCA可通過降低Bcl-2/Bax蛋白比值及增加Fas、FasL的表達(dá)，啟動(dòng)外源性、內(nèi)源性凋亡途徑，激活下游的效應(yīng)Caspase-3，促使睪丸細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而引起生精細(xì)胞脫落、數(shù)量減少，最終引發(fā)精子生成障礙、曲細(xì)精管萎縮。
　　6. TCC

18、A對(duì)大鼠睪丸鋅、鈣、銅含量的影響
　　在275、550mg/kg劑量水平下，連續(xù)10周間隔染毒TCCA，采用原子吸收光譜法檢測(cè)睪丸內(nèi)鋅、鈣、銅的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：275、550mg/kg劑量組大鼠睪丸內(nèi)鈣含量分別為16.66±8.85 mg/kg、14.42±8.67 mg/kg，均低于對(duì)照組大鼠睪丸內(nèi)鈣的含量18.36±7.52 mg/kg，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；275、550mg/kg劑量組大鼠睪丸內(nèi)鋅的含量分別為24.00±5.

19、70 mg/kg、22.83±2.59mg/kg，均低于對(duì)照組睪丸鋅含量24.41±7.88 mg/kg，其中550mg/kg劑量組大鼠睪丸鋅含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；275、550mg/kg劑量組大鼠睪丸內(nèi)銅的含量分別為1.99±0.37 mg/kg、1.59±0.46mg/kg，均低于對(duì)照組睪丸鋅含量2.03±0.87mg/kg，其中550mg/kg劑量組大鼠睪丸銅含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　在96

20、.5 mg/kg、193mg/kg劑量水平下12周齡成年大鼠連續(xù)10天染毒TCCA，通過檢測(cè)附睪內(nèi)精子數(shù)量、精子活動(dòng)率及精子形態(tài)，評(píng)價(jià) TCCA對(duì)大鼠精子質(zhì)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組、96.5 mg/kg、193mg/kg組其精子數(shù)量分別為443.6±98.2、428.5±80.3和420.9±78.9×106/g，精子活動(dòng)率均降低，分別為：82.9%、75.6%和64.84%，且染毒水平越高，大鼠附睪內(nèi)精子數(shù)目和精子運(yùn)動(dòng)率降低越明

21、顯（P＜0.05,P＜0.01）。
　　7. TCCA對(duì)大鼠精子質(zhì)量的影響
　　采用伊紅染色顯微鏡下觀察大鼠睪丸精子形態(tài)，未見及精子頭尾相連、卷尾、小頭、無定型頭、無頭、無尾等幾類畸形精子。
　　8. TCCA對(duì)SD血液系統(tǒng)的影響
　　在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑量水平下連續(xù)染毒24個(gè)月，分別于實(shí)驗(yàn)第6、12、18、24個(gè)月時(shí)，定期采集大鼠血液進(jìn)行血液系統(tǒng)常規(guī)和血生化檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在

22、某些檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)某數(shù)個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目與對(duì)照組相比增加或降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05、P<0.01、P<0.001），但這種差異在各劑量組間的分布無明顯規(guī)律性，未發(fā)現(xiàn)有明顯的劑量-效應(yīng)反應(yīng)關(guān)系。表明在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1劑量水平下連續(xù)24個(gè)月染毒，TCCA對(duì)雄性SD大鼠血液系統(tǒng)無明顯的毒性作用。
　　在96.5、193mg/kg劑量水平下連續(xù)10天染毒TCCA，4周齡幼年大鼠各個(gè)劑量組與12周齡大鼠96.

23、5mg/kg劑量組大鼠血中AKP、ALT、AST、LDH的酶活性及血清離子Ca2+、Cl-、K+、Na+的濃度均無明顯差異；12周齡大鼠193mg/kg劑量組血清LDH活性升高，血中Ca2+、Cl—降低（P<0.05），其他指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無顯著性。
　　以上結(jié)果提示：TCCA對(duì)血液系統(tǒng)的影響與染毒水平有關(guān)，在在193mg/kg劑量水平下，TCCA能引起血液內(nèi)LDH活性升高，Ca2+、Cl—濃度降低。
　　結(jié)論：

24、r>　　1、TCCA對(duì)大鼠的長(zhǎng)、短期染毒均能導(dǎo)致睪丸組織學(xué)形態(tài)發(fā)生改變，并以睪丸重量減輕、睪丸曲細(xì)精管萎縮為主要改變，TCCA對(duì)雄性SD大鼠睪丸具有明顯的生殖毒性。
　　2、 TCCA對(duì)睪丸損傷程度與TCCA接觸水平、接觸時(shí)間呈量效關(guān)系，即睪丸的損傷程度隨TCCA染毒水平的增加而加重，隨接觸時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。
　　3、TCCA可引起大鼠精子數(shù)量減少、精子運(yùn)動(dòng)率降低，但未發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致精子畸形的發(fā)生。
　　4、TCCA促進(jìn)

25、睪丸生精細(xì)胞凋亡的發(fā)生是其毒性作用方式之一。睪丸細(xì)胞凋亡的增加與TCCA下調(diào)睪丸內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)FasL和Caspase-3蛋白表達(dá)及Fas mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)水平有關(guān)。
　　5、 TCCA可通過降低睪丸內(nèi)鋅、銅的含量，發(fā)揮其對(duì)睪丸的生殖毒性作用。
　　6、 TCCA對(duì)大鼠行為活動(dòng)、體重、血液系統(tǒng)的影響與染毒劑量水平有關(guān)。TCCA對(duì)雄性SD大鼠24月飼喂給藥的最大無作用劑量為0.71 mg·k