壬基酚對(duì)雄性SD大鼠生殖系統(tǒng)功能的影響.pdf

1、目的:壬基酚(nonylphenol,NP)是一種廣泛使用的化工原料,主要用于合成洗滌劑、造紙、紡織印染、皮革化工、乳液聚合、農(nóng)藥等工業(yè)領(lǐng)域。隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,我國(guó)每年都有大量的壬基酚通過(guò)工業(yè)“三廢”及生活污水進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)。壬基酚具有擬雌激素活性,是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。環(huán)境中極低濃度的壬基酚即可通過(guò)生物蓄積效應(yīng)和食物鏈傳遞,潛在危害生物體的內(nèi)分泌、生殖、免疫、神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)機(jī)能。目前,關(guān)于雄性動(dòng)物成年期壬基酚染毒對(duì)生殖器官、性激素

2、水平及精子受精功能影響的研究較少,特別是精子頂體相關(guān)指標(biāo)、附睪抗氧化狀態(tài)及凋亡等方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)對(duì)成年雄性SD大鼠灌胃染毒,研究壬基酚對(duì)大鼠睪丸、附睪和精子的損傷作用,探討其對(duì)雄性大鼠生殖功能的影響及其可能的毒作用機(jī)制。
　　方法:32只健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體重隨機(jī)分為4組:溶劑對(duì)照組(玉米油)和低(40mg/kg)、中(100mg/kg)、高劑量(250mg/kg)壬基酚染毒組,每

3、組8只。從大鼠12周齡開(kāi)始,采取灌胃方式染毒,容量1.5ml/kg,隔天上午染毒1次,連續(xù)90d。(1)一般狀況及體重:每日觀察動(dòng)物的飲食和活動(dòng)情況,注意大鼠被毛、皮膚、眼睛、呼吸以及日常行為方面的變化。隔天稱(chēng)重一次;(2)大鼠處死后,分離雙側(cè)睪丸、附睪和附睪尾,稱(chēng)重,并計(jì)算相應(yīng)的臟器系數(shù);(3)蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察大鼠睪丸組織病理學(xué)改變;(4)腹主動(dòng)脈采血,分離血清,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清睪酮水平;(5)制備附

4、睪尾精子懸液,利用光學(xué)顯微鏡及活細(xì)胞工作站,計(jì)數(shù)精子濃度、畸形率和活動(dòng)度;(6)通過(guò)使用相應(yīng)熒光探針和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)精子存活率、頂體完整性、線粒體膜電位(MMP)和游離鈣離子([Ca2+]i)水平;(7)采用改良Kenndy法檢測(cè)精子頂體酶活性;(8)通過(guò)流式細(xì)胞儀和熒光染料(H2DCFDA)檢測(cè)附睪尾精子活性氧(ROS)水平;(9)利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)附睪組織抗氧化物酶((超氧化物歧化酶,SOD)和(過(guò)氧化氫酶,CAT))活性;(

5、10)使用TUNEL法評(píng)估壬基酚對(duì)附睪凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)果:(1)染毒后,各劑量壬基酚染毒組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、稀便、被毛不舒展、毛發(fā)灰暗甚至脫毛現(xiàn)象,組間差異不明顯。高劑量組大鼠在灌胃時(shí)反抗較強(qiáng)烈,攻擊性行為在染毒后期明顯增強(qiáng)。各染毒組大鼠體重與溶劑對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)與溶劑對(duì)照組比較,僅低、高壬基酚染毒組大鼠的附睪重量顯著下降。各染毒組大鼠睪丸、附睪和附睪尾的臟器系數(shù)與溶劑對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、(3)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),溶劑對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管排列緊密、結(jié)構(gòu)完整,生精上皮基膜完整,各級(jí)生精細(xì)胞層排列規(guī)則、層次清楚;低劑量壬基酚染毒組曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)相對(duì)規(guī)則、大小一致,管間隙略有增大,生精細(xì)胞層基本完整;中、高劑量壬基酚染毒組睪丸出現(xiàn)部分曲細(xì)精管萎縮、管間隙增大,生精細(xì)胞層變薄、結(jié)構(gòu)排列紊亂,管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量減少,部分管腔可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞碎片。(4)與溶劑對(duì)照組比較,低劑量壬基酚染毒組大鼠血清睪酮水平略有升高,中、高劑量組睪酮水平

7、有所降低,但僅高劑量組睪酮水平降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)附睪尾精子計(jì)數(shù)、活動(dòng)度隨著染毒劑量的增加而逐漸降低,而精子畸形率隨著染毒劑量的增加而逐漸升高。與溶劑對(duì)照組比較,中、高劑量壬基酚染毒組大鼠附睪尾精子數(shù)量顯著減少、活動(dòng)度顯著降低、畸形率顯著增加。(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組比較,中、高劑量壬基酚染毒組精子的(PI-/PNA+)％明顯升高;高劑量壬基酚染毒組大鼠精子hMMP％顯著降低;各劑量壬基酚染毒組大鼠精子存

8、活率和[Ca2+]i水平均無(wú)明顯變化;隨壬基酚染毒劑量的升高,精子頂體完整性和MMP的水平呈逐漸降低的趨勢(shì)。(7)與溶劑對(duì)照組比較,高劑量壬基酚染毒組精子的頂體酶活力下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨著壬基酚染毒劑量的升高,精子頂體酶活力呈逐漸降低的趨勢(shì)。(8)與溶劑對(duì)照組比較,壬基酚染毒組大鼠精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平均有所升高,但僅高劑量組精子 ROS顯著升高。(9)與溶劑對(duì)照組比較,壬基酚染毒組大鼠附睪組織SOD和CAT活性均有所下降,其中低、

9、高劑量組CAT活性以及高劑量組SOD活性均顯著下降。(10)TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示:各組大鼠附睪組織均見(jiàn)凋亡陽(yáng)性信號(hào)表達(dá),且凋亡細(xì)胞主要是退化的附睪管上皮細(xì)胞,位于附睪管基底部;與溶劑對(duì)照組比較,低、高劑量壬基酚染毒組大鼠附睪組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著升高;高劑量組附睪組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度呈強(qiáng)陽(yáng)性,其余劑量組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度呈陽(yáng)性。
　　結(jié)論:(1)壬基酚于大鼠成年期在體暴露,可使附睪重量明顯下降,提示壬基酚對(duì)附睪組織存在

10、損害作用;同時(shí)壬基酚染毒對(duì)大鼠體重和睪丸重量則未顯現(xiàn)出明顯的影響。(2)組織病理學(xué)檢查提示,隨壬基酚染毒劑量的增加,睪丸曲細(xì)精管損傷程度逐漸加重。(3)壬基酚可導(dǎo)致血清睪酮水平明顯降低,提示壬基酚能擾亂內(nèi)分泌激素水平,從而對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。(4)壬基酚暴露可使大鼠附睪尾精子數(shù)量顯著減少、畸形率顯著增加,提示壬基酚可能造成成年雄性生精障礙。(5)壬基酚暴露可影響精子活動(dòng)度、MMP、頂體完整性及頂體酶活性,表明壬基酚對(duì)精子受精功能

11、具有一定損傷作用;但是壬基酚對(duì)精子存活率和[Ca2+]i沒(méi)有明顯的影響作用,提示 NP對(duì)精子受精功能的影響可能不是通過(guò)改變[Ca2+]i水平而發(fā)揮作用的。(6)壬基酚暴露可升高大鼠附睪尾精子ROS水平,造成精子氧化應(yīng)激增加。提示,壬基酚所致精子ROS增加可能是影響精子受精功能的機(jī)制之一。(7)壬基酚暴露可影響附睪組織SOD和CAT活性,也可誘導(dǎo)附睪組織發(fā)生凋亡。提示壬基酚對(duì)附睪組織具有一定毒性,可能是造成臟器重量降低及精子功能變化的原因