藍(lán)細(xì)菌光受體色素化及晶體結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、藻膽蛋白是偶聯(lián)藻膽色素的色素蛋白，在生物體內(nèi)充當(dāng)光受體。藻膽蛋白光受體可分為兩類:天線藻膽蛋白、光敏藻膽蛋白。天線藻膽蛋白捕獲光能并傳遞能量給光合作用系統(tǒng)，而光敏藻膽蛋白將光信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號，稱為光敏色素蛋白。藍(lán)細(xì)菌藻膽蛋白的天線復(fù)合物顯示出高熒光特性，但也有明顯的缺陷，在使其用做于良好的熒光標(biāo)記物時，需要特定的色素合成酶以及藻膽蛋白裂合酶參與。近年，藍(lán)細(xì)菌光敏色素的研究已有一些進(jìn)展。保守的GAF結(jié)構(gòu)域能自催化結(jié)合多種色素，包括B

2、V、PCB、PVB甚至PEB、PUB。這一優(yōu)良特性比藻膽蛋白用作可基因編碼的熒光探針具有更多優(yōu)點(diǎn)，大大增強(qiáng)了當(dāng)前色素蛋白用作熒光探針的應(yīng)用潛力。
　　本實(shí)驗(yàn)室重組合成了一些在藍(lán)藻體內(nèi)并不存在的色素蛋白。這些色素蛋白雖然在天然藍(lán)藻體內(nèi)并不存在，但卻可在體外利用不同色素與脫輔基蛋白組合生成，這在應(yīng)用開發(fā)上具有很大潛力。利用這種重組方式，可定向選擇合成人們需要的產(chǎn)物，如:熒光量子產(chǎn)率更高或者光譜范圍更廣的色素?zé)晒獾鞍?，將他們用作?yōu)良的熒

3、光標(biāo)記材料。
　　本論文嘗試了來自三個藻種Nostoc sp.PCC 7120、Synechocystis sp.PCC 6803以及Thermosynechococcus elongatus BP-1中的16個GAF，分別與PEB色素合成酶基因在大腸桿菌體內(nèi)共表達(dá)，產(chǎn)生色素蛋白PEB-GAF或PUB-GAF。其中9個可在大腸桿菌體內(nèi)自催化色素化結(jié)合上PEB，并產(chǎn)生如熒光蛋白GFP一樣的高熒光。將GAFs用PEB色素化，得到四個十

4、分有趣的熒光蛋白:PEB-All2699GAF1、PUB(PEB)-All3691GAF2、PEB(PUB)-All1280GAF2。PEB-All2699GAF1最大熒光峰在586nm，發(fā)射橙紅色熒光。PUB(PEB)-All3691GAF2最大熒光峰在498nm，發(fā)射綠色熒光。PEB(PUB)-All1280GAF2與PEB(PUB)-Slr1393GAF3相同，熒光在575nm處，有60-80nm的斯托克斯位移，發(fā)射橙色熒光。結(jié)合

5、色素PEB且發(fā)生色素異構(gòu)化的GAFs，可用作綠色、橙色、紅色熒光標(biāo)記物。用PEB色素化的GAFs，有以下優(yōu)勢:(1)GAF是一個偶聯(lián)色素的小單位，其不需要裂合酶的催化。(2)PEB色素化后的GAFs有大的摩爾消光系數(shù)和高的熒光量子產(chǎn)率及亮度。(3)某些GAFs含有DXCF基序可將PEB異構(gòu)為PUB，增加了PEB(PUB)-GAFs光譜的多樣性。將熒光蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，通過熒光顯微鏡的觀察，可見明亮的熒光細(xì)胞。
　　盡

6、管GAF可自催化結(jié)合色素，但仍需要與色素合成酶基因共表達(dá)，而GFP作為熒光蛋白，不需要其他的輔助因子。因此，為了簡化光敏色素合成途徑，本論文用首尾相連逐步融合基因的方法解決這個問題。本論文將ho1和pebS先融合成一個基因編碼框ho1∶pebS，然后再將gaf插入融合基因ho1∶pebS的5'末端。構(gòu)建的融合基因gaf∶ho1∶pebS連入表達(dá)載體后可在宿主細(xì)胞中直接誘導(dǎo)表達(dá)。本論文將實(shí)驗(yàn)室已有的來自于Nostocsp.PCC7120的

7、all2699的GAF結(jié)構(gòu)域編碼基因gaf1、all1280的gaf2以及來自Synechocystis sp.PCC6803中的基因slr1393的gaf3分別與PEB色素合成酶基因ho1∶pebS融合，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生了色素蛋白PEB-GAF∷HO1∷PebS或PUB-GAF∷HO1∷PebS。光譜分析表明，光譜特征與簡化前基本一致。這些經(jīng)過分子設(shè)計的光敏色素復(fù)合物成為極有潛力的活細(xì)胞熒光生物標(biāo)記物。
　　色素

8、化的GAFs可以進(jìn)一步通過GCN4亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)其寡聚化，以增強(qiáng)它們的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。PEB可部分地向PUB轉(zhuǎn)化，使寡聚的GAF“束”形成類似藍(lán)藻中的捕光天線復(fù)合物中有趣的能量轉(zhuǎn)移模型。良好的熱、光化學(xué)穩(wěn)定性及其強(qiáng)烈的熒光亮度，可成為極有潛力的熒光免疫檢測標(biāo)記物。
　　這些結(jié)果通過光譜分析、熒光顯微鏡技術(shù)得以證實(shí)。色素?zé)晒獾鞍變?yōu)異的光譜性質(zhì)是GFP家族熒光蛋白的很好補(bǔ)充，尤其是它具有的橙紅色熒光將為組織深度成像，

9、超分辨顯微技術(shù)，甚至三維數(shù)據(jù)存儲技術(shù)提供便利。
　　為對經(jīng)分子設(shè)計的色素?zé)晒獾鞍走M(jìn)行進(jìn)一步的分子優(yōu)化，本論文在基因片段修剪克隆的基礎(chǔ)上，成功實(shí)現(xiàn)重組PEB-GAF復(fù)合物的高效表達(dá)，實(shí)驗(yàn)鑒定其保持有正確的光譜活性，運(yùn)用PDB數(shù)據(jù)庫中已解析的GAF同源結(jié)構(gòu)域成功解析了PEB-All2699GAF1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分辨率達(dá)1.7(A)的晶體。在分析結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了系列定點(diǎn)突變究，設(shè)計、構(gòu)建、表達(dá)了3個相關(guān)突變體，結(jié)合相關(guān)生理實(shí)驗(yàn)分析，