與小型非編碼RNA相關(guān)的血吸蟲(chóng)基因操作技術(shù)研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)屬于扁形動(dòng)物門(mén)裂體吸蟲(chóng)綱，感染后所引起的血吸蟲(chóng)病是僅次于瘧疾的世界第二大寄生蟲(chóng)疾病。血吸蟲(chóng)病的急性癥狀包括尾蚴皮炎和一系列超敏反應(yīng)，而慢性血吸蟲(chóng)感染往往造成泌尿系統(tǒng)或肝腸部位的病理?yè)p傷。目前，針對(duì)三種主要血吸蟲(chóng)病病原（曼氏血吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)）的基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，下一步的工作將是針對(duì)那些組學(xué)揭示的蛋白編碼基因或具有調(diào)控功能的小RNA基因進(jìn)行功能研究。
　　RNA干擾（RNAi）是一類(lèi)發(fā)生于真核

2、細(xì)胞或病毒中的由雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象，siRNA與miRNA代表了兩種主要的RNAi誘發(fā)因子。siRNA通常作為一種反向遺傳學(xué)工具被用于蛋白編碼基因的功能研究，miRNA則是一種內(nèi)源的基因表達(dá)調(diào)控分子，在不同生物體中具有重要的生理功能。本研究將圍繞siRNA和miRNA這兩種小型非編碼RNA分子，探索相關(guān)的血吸蟲(chóng)基因操作技術(shù)。
　　首先，我們將外源siRNA引發(fā)的RNAi作為一種技術(shù)工具來(lái)進(jìn)行日本血吸蟲(chóng)醛糖還原酶(Sj

3、AR)基因的功能研究。針對(duì)SjAR基因的前期基礎(chǔ)性研究推測(cè)其可能參與了蟲(chóng)體的抗宿主氧化機(jī)制，同時(shí)證實(shí)了基于SjAR蛋白三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出的候選藥物具有良好的殺蟲(chóng)效果。本研究首先設(shè)計(jì)并合成了兩條針對(duì)SjAR轉(zhuǎn)錄本不同位置的siRNA，嘗試使用電轉(zhuǎn)和浸泡兩種手段向感染后14天的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)中轉(zhuǎn)化siRNA分子。在完成了蟲(chóng)體RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄等步驟后，用熒光定量PCR檢測(cè)SjAR基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，浸泡法實(shí)施的RNAi成功地降低了S

4、jAR在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，siRNA處理組的SjAR轉(zhuǎn)錄本水平顯著地低于對(duì)照組。然而，電轉(zhuǎn)法實(shí)施的RNAi并未取得理想的效果，siRNA處理組與對(duì)照組的SjAR轉(zhuǎn)錄本水平并沒(méi)有顯著性差異。此后，我們使用Western雜交的方法檢測(cè)了浸泡法處理對(duì)于SjAR蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示siRNA處理組蟲(chóng)體的SjAR蛋白含量確實(shí)低于對(duì)照組。對(duì)SjAR基因表達(dá)水平降低的蟲(chóng)體進(jìn)行顯微觀察并未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。
　　此外，我們對(duì)血吸蟲(chóng)內(nèi)源m

5、iRNA調(diào)控功能開(kāi)展了研究。為了驗(yàn)證血吸蟲(chóng)miRNA與靶信使RNA（mRNA）的互作關(guān)系，我們開(kāi)發(fā)了針對(duì)血吸蟲(chóng)的miRNA海綿技術(shù)平臺(tái)。熒光蛋白和熒光素酶作為兩種報(bào)告基因被用于了miRNA海綿轉(zhuǎn)錄本表達(dá)效果的驗(yàn)證;而電轉(zhuǎn)被當(dāng)做轉(zhuǎn)化方法以實(shí)現(xiàn)外源基因在血吸蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)。針對(duì)GFP、Cherry兩種熒光蛋白質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化操作并不能誘發(fā)明顯的蟲(chóng)體發(fā)光現(xiàn)象，且蟲(chóng)體本身就具有的自發(fā)熒光現(xiàn)象影響了熒光蛋白做為報(bào)告基因在血吸蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用。然而

6、，隨后對(duì)于熒光素酶mRNA或質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化操作獲得了良好的結(jié)果，蟲(chóng)體表達(dá)的熒光素酶能夠高效地催化底物發(fā)光。不僅如此，當(dāng)在熒光素酶編碼序列的下游引入串聯(lián)重復(fù)的血吸蟲(chóng)miR-71結(jié)合單位后，蟲(chóng)體表達(dá)的熒光素酶活力顯著下降。以上結(jié)果證明了應(yīng)用以熒光素酶為報(bào)告基因的miRNA海綿進(jìn)行血吸蟲(chóng)miRNA調(diào)控功能研究的可行性。
　　隨后，我們對(duì)日本血吸蟲(chóng)miR-71的作用靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，共得出了5個(gè)可能被miR-71調(diào)控的日本血吸蟲(chóng)基因