傷害沙門菌非編碼RNA AsrC的相關功能研究.pdf

1、目的:
　　 近十年來，通過生物學預測和計算機分析、基因芯片篩查以及高通量測序等手段，在細菌基因組內已經發(fā)現(xiàn)了一批非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)，它們作為基因表達的調控因子，在細菌中發(fā)揮重要作用。AsrC為本實驗室在傷寒沙門菌中新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其基因位于rseC的互補鏈，本論文擬研究該非編碼RNA在傷寒沙門菌中的相關功能。
　　 方法:
　　 1.傷寒沙門菌AsrC高表達菌株的構建。根

2、據Northern鑒定出的AsrC，以及5’和3'RACE（末端快速擴增技術）找到的轉錄起始及終止位點，從前期測序中找到該段全長序列。在5’起始端上游140bp處和3’終止端處分別設計上下游引物，擴增獲得目的片段，經NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，與同樣酶切后的低拷貝質粒pBAD/Myc-HisA定向連接，并克隆至大腸埃希菌TOP10。經PCR、酶切驗證和測序分析鑒定后，將陽性重組質粒和空質粒分別電擊導入傷寒沙門菌野生株，作為AsrC高表達

3、菌株和空質粒對照株。
　　 2.AsrC高表達菌株在不同條件下的生長曲線測定。以生長時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制生長曲線，對比AsrC高表達菌株和空質粒對照株在正常及酸、氧、高滲應激條件下的生長情況。
　　 3.AsrC高表達菌株的基因表達譜分析。將AsrC高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數期(OD6000.4)，加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導1h后分別提取總RNA，反轉錄為cDNA并配對互標熒光素cy3

4、和cy5，利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術，與基因組芯片雜交，掃描后將熒光信號數據化，分析比較傷寒沙門菌AsrC高表達菌株和空質粒對照株的基因表達譜差異。
　　 4.AsrC高表達菌株的動力實驗。將AsrC高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數期(OD6000.4)后加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導1h，分別取野生株、asrC啟動子缺失株、AsrC高表達菌株和空質粒對照株的2.5μl菌液點種于0.3％的等滲半固體LB培養(yǎng)基，3

5、7℃培養(yǎng)8h后測量動力圈直徑，兩兩比較細菌的動力。
　　 5.AsrC高表達菌株的上皮細胞侵襲實驗。將AsrC高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數期(OD6000.4)，在0.2％（w/v）的阿拉伯糖誘導1h后，分別把野生株、asrC啟動子缺失株、AsrC高表達菌株和空質粒對照株加入培養(yǎng)有HeLa細胞的24孔板中（MOI均為20）。培養(yǎng)90min后將部分孔的細胞破膜，收集菌體后涂板過夜，菌落數代表細菌粘附細胞水平(T0);另一部分

6、孔的細胞加入慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)90min后，破膜涂板過夜，菌落數代表細菌侵襲水平(T90)，以T90/T0值代表細菌的侵襲力。
　　 6.AsrC高表達菌株在THP-1細胞內生存實驗。將AsrC高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數期(OD6000.4)，在0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導1h后，分別把野生株、asrC啟動子缺失株、AsrC高表達菌株和空質粒對照株加入培養(yǎng)有THP-1細胞的24孔板中（MOI均為10）。培養(yǎng)1h后加入慶

7、大霉素，再作用1h后將部分孔的細胞破膜，收集菌體后涂板過夜，計菌落數(T0)表示基礎細菌吞噬水平;另一部分孔的細胞繼續(xù)培養(yǎng)12或24h，破膜后涂板過夜，菌落數(T12或T24)代表胞內細菌增殖水平，T12/T0和T24/T0表示細菌在THP-1細胞內生存力。
　　 7.qRT-PCR對傷寒沙門菌rseCmRNA的穩(wěn)定性分析。將AsrC高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數期(OD6000.4)，不加或加入0.2％（w/v）的阿拉伯糖

8、繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20min，以TRIzol提取總RNA后進行逆轉錄及qRT-PCR，分析rseCmRNA的水平變化趨勢。
　　 結果:
　　 1.經酶切驗證和測序分析鑒定，成功構建pBAD-asrC陽性重組載體，并將該1034bp的asrC高表達片段導入野生株GIFU10007，表明傷寒沙門菌AsrC高表達菌株制備成功。
　　 2.生長曲線表明，在正常及酸、氧、高滲應激條件下，AsrC高表達菌株和空質粒對照株并

9、無明顯差異。
　　 3.基因芯片結果顯示，高表達AsrC后，有41個基因表達上調，主要涉及鞭毛、侵襲和代謝相關基因;有23個基因表達下調，主要為代謝相關基因。
　　 4.動力實驗表明，asrC啟動子缺失株的動力比野生株有所下降，而AsrC高表達菌株的動力較空質粒對照株明顯升高。
　　 5.與野生株相比，asrC啟動子缺失株對上皮細胞的侵襲力有所降低，而高表達AsrC后的菌株在侵襲力上較空質粒對照株有明顯提高。

10、r>　　 6.與野生株相比，asrC啟動子缺失株在THP-1細胞內的生存能力無明顯變化，而高表達AsrC后的菌株在生存能力上較空質粒對照株有所下降。
　　 7.qRT-PCR結果顯示，AsrC的高表達可以提高rseCmRNA的穩(wěn)定性。
　　 結論:
　　 傷寒沙門菌的非編碼反義RNAAsrC在高表達后，對細菌在正常及酸、氧、高滲應激條件下的生長無明顯影響;但其可影響細菌的動力、侵襲力及胞內生存力;同時其可增強r