桉樹(shù)青枯病生物防治研究.pdf

1、本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌的BOX-PCR指紋圖譜分析及鑒定，利用植物內(nèi)生細(xì)菌及鏈霉菌防治桉樹(shù)青枯病，對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌、鏈霉菌及根際細(xì)菌在桉樹(shù)體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律的研究，為桉樹(shù)青枯病的生物防治打下了基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下: 1.植物內(nèi)生細(xì)菌的BOX-PCR指紋圖譜分析及鑒定本研究利用植物內(nèi)生細(xì)菌CN017對(duì)BOX-PCR技術(shù)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并將篩選出的優(yōu)化因子應(yīng)用于不同來(lái)源的內(nèi)生細(xì)菌CN008、CN015、CN017、CN030、CN06

2、1、CN062、CN063、CN064、CN078及根際細(xì)菌WCS358、WCS374、WCS417、7NSK2的BOX-PCR指紋圖譜分析，將其中6種細(xì)菌的分析結(jié)果與它們的16S rDNA序列的聚類分析進(jìn)行了比較；通過(guò)Biolog生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，對(duì)CN015、CN017、CN064、CN078四種細(xì)菌進(jìn)行了初步的鑒定。試驗(yàn)篩選出適于待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌的25μL優(yōu)化體系中dNTP和引物以及Taq酶的用量為:dNTP0.

3、2 mmol/L，引物50pmol，2UTaq酶；對(duì)13種細(xì)菌的BOX-PCR指紋圖譜分析表明，PCR產(chǎn)物在200～2300bp位置有多條特定的電泳帶，可較好地揭示不同菌株間的差異；其中6種細(xì)菌的BOX-PCR聚群結(jié)果與16S rDNA序列分析有較好的一致性，說(shuō)明BOX-PCR技術(shù)是一種快速而有效的DNA指紋技術(shù)，尤其適用于分析大量的菌株或分離株。經(jīng)Biolog生理生化鑒定和16S rDNA序列分析將4種內(nèi)生細(xì)菌初步確定為:CN015為

4、Pseudomonas putida、CN017為P.poae、CN064為P.synxartha、CN078為P.fluorescens。 2.植物內(nèi)生細(xì)菌防治桉樹(shù)青枯病本試驗(yàn)測(cè)定了植物內(nèi)生細(xì)菌CN030、CN064、CN078對(duì)青枯病菌的平板拮抗活性，并利用CN015r、CN017r、CN030、CN064、CN078在離體條件下、無(wú)菌條件下及土壤系統(tǒng)中進(jìn)行桉樹(shù)青枯病的防治研究；為提高其防效，在土壤系統(tǒng)中進(jìn)行了內(nèi)生細(xì)菌有效載

5、體的篩選。在KB平板培養(yǎng)基上CN078和CN064對(duì)青枯菌都有明顯的拮抗活性，其中CN078效果最好，抑菌圈達(dá)到33.5mm。離體條件下，采用內(nèi)生細(xì)菌與青枯菌菌懸液進(jìn)行比例混合，CN015r、CN017r、CN064、CN078對(duì)桉樹(shù)青枯病有明顯的防治效果，而CN030發(fā)病率達(dá)到了88.8％沒(méi)有防治效果；在無(wú)菌條件下，青枯病菌對(duì)尾葉桉無(wú)菌實(shí)生苗具有很強(qiáng)的致病性，經(jīng)篩選確定河沙中青枯菌量為2.5×100CFU·g-1，與對(duì)照相比CN017

6、r、CN064、CN078對(duì)于桉樹(shù)青枯病具有較強(qiáng)防治效果，CN030對(duì)桉苗的正常生長(zhǎng)有一定的影響。在土壤系統(tǒng)中接種青枯病菌15 d后，CN015r、CN017r、CN064防治效果達(dá)到差異水平，CN030、CN078與對(duì)照相比沒(méi)有差異。測(cè)定的四種載體在土壤系統(tǒng)中，對(duì)于對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌對(duì)于桉樹(shù)青枯病的防治效果沒(méi)有明顯的提高，且四種載體對(duì)于桉苗的生長(zhǎng)均有一定的影響。 3.利用鏈霉菌防治桉樹(shù)青枯病本試驗(yàn)從桉樹(shù)中進(jìn)行了內(nèi)生鏈霉菌的分離，并對(duì)

7、分離到的菌株與內(nèi)生鏈霉菌CN120、CN121(從棗樹(shù)果實(shí)中分離)及金色鏈霉菌、武夷菌素鏈霉菌、龜裂鏈霉菌、玫瑰黃鏈霉菌對(duì)于青枯病菌的平板拮抗活性進(jìn)行了測(cè)定，將對(duì)桉樹(shù)青枯病菌具有拮抗活性的菌株在不同的系統(tǒng)中進(jìn)行了防效測(cè)定。試驗(yàn)從尾巨桉中分離到一株鏈霉菌CN122(初步鑒定為鏈霉菌)，在平板KB培養(yǎng)基上龜裂鏈霉菌、武夷菌素鏈霉菌和CN122對(duì)青枯菌都有明顯的拮抗活性，其它菌株沒(méi)有效果。在離體條件下，龜裂鏈霉菌、CN122處理桉苗在第10d

8、的發(fā)病率與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平，而武夷菌素鏈霉菌發(fā)病率較對(duì)照有所增高；無(wú)菌條件下，CN122的發(fā)病率與對(duì)照相比下降了40％，龜裂鏈霉菌第20d時(shí)發(fā)病率與對(duì)照相比也存在一定差異。土壤系統(tǒng)中，對(duì)第10d的發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，在α=0.05時(shí)CN122防治效果達(dá)到差異水平，龜裂鏈霉菌與對(duì)照相比沒(méi)有差異:至15d，龜裂鏈霉菌、CN122發(fā)病率與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平。 4.植物內(nèi)生菌、鏈霉菌及根際細(xì)菌在桉樹(shù)體內(nèi)的定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律本試驗(yàn)在

9、無(wú)菌條件下，對(duì)植物內(nèi)生菌、鏈霉菌、根際細(xì)菌在桉樹(shù)體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，無(wú)菌條件下萌發(fā)的桉苗內(nèi)未檢測(cè)到可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌；通過(guò)浸種處理、桉苗與細(xì)菌共培養(yǎng)、葉片接種和菌液蘸根的方法，內(nèi)生細(xì)菌CN017r均可以進(jìn)入桉樹(shù)無(wú)菌實(shí)生苗體內(nèi)，其中以桉苗與細(xì)菌共培養(yǎng)的方法，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌定殖的數(shù)量最多(7.651g CFU.g-1)，其次是浸種處理和菌液蘸根；通過(guò)葉片接種后CN017r能夠在接種葉片內(nèi)很好的定殖，并且向下部葉片運(yùn)轉(zhuǎn)。CN017

10、r在不同的桉樹(shù)中均可以定殖，所測(cè)三種桉樹(shù)同一時(shí)間根部和莖中段內(nèi)生細(xì)菌CN017r定殖的數(shù)量，以鄧恩桉最多，其次是尾葉桉和赤桉，第30d時(shí)檢測(cè)只在尾葉桉的頂芽檢測(cè)到少量?jī)?nèi)生菌(4.751g CFU.g-1)；內(nèi)生細(xì)菌CN015r、CN017r、CN064、CN078對(duì)于尾葉桉并無(wú)?；?，都能夠在桉苗根部定殖，除CN017r外的三種內(nèi)生細(xì)菌在30d內(nèi)都沒(méi)有到達(dá)植株頂芽。鏈霉菌CN122能夠在尾葉桉體內(nèi)定殖，但是定殖數(shù)量較內(nèi)生細(xì)菌少，龜裂鏈霉