櫛孔扇貝生殖相關(guān)基因DEAD-box家族和boule的cDNA克隆及其發(fā)育表達(dá)圖式.pdf

1、本文采用同源克隆策略，在櫛孔扇貝中分離獲得了生殖相關(guān)的DEAD-box家族基因中的Cf-vasa、Cf-PL10和Cf-p68以及DAZ家族基因中的Cf-boule的cDNA，對其進(jìn)行了序列特征和時(shí)空表達(dá)分析，并以Cf-vasa mRNA為標(biāo)記，鑒定了櫛孔扇貝原生殖細(xì)胞起源的方式和時(shí)間，及其在早期幼蟲發(fā)育中的遷移。 DEAD-box家族基因編碼一類ATP依賴的RNA解旋酶，該家族蛋白被分為VASA．PL10和p68三個(gè)亞家族。其

2、中，vasa在許多生物中為原生殖細(xì)胞形成和配子發(fā)生所需，一些PL10相關(guān)基因(人的DBY和果蠅的bel)則參與了配子發(fā)生。從櫛孔扇貝精巢中克隆得到的。DEAD-box基因Cf-vasa、Cf-PL10和Cf-p68的cDNA全長分別為5578 bp、2494 bp和2950 bp，開放閱讀框分別編碼801、760和703個(gè)氨基酸的蛋白。Cf-VASA、Cf-PL10和Cf-p68蛋白具有DEAD—box家族共有的9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和GG重復(fù)

3、序列，Cf-VASA、Cf-PL-10具有特有的ARKF框，Cf-VASA的N端區(qū)域存在3個(gè)特有的鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC框)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示3個(gè)蛋白首先與各自的亞家族成員聚類，證明櫛孔扇貝Cf-vasa、Cf-PL10和Cf-p68基因在進(jìn)化上高度保守?？臻g表達(dá)的RT-PCR分析和性腺發(fā)育周期的原位雜交結(jié)果顯示，Cf-vasa在除成熟精子外的所有生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，表明該基因可能參與櫛孔扇貝兩性配子的發(fā)生。胚胎和幼蟲RT-PCR分析檢測到

4、受精卵至原腸胚的各期胚胎都含有Cf-vasa mRNA。整體原位雜交結(jié)果顯示Cf-vasa mRNA在受精卵植物極呈高密度集中分布，并隨卵裂傳遞至早期胚胎的特定分裂球，原腸胚中含Cf-vasa mRNA的細(xì)胞增至2個(gè)，且隨之后的幼蟲發(fā)育逐漸增多。根據(jù)以上結(jié)果推測，Cf-vasa mRNA可能作為母源生殖質(zhì)成分參與櫛孔扇貝原生殖細(xì)胞的決定形成。表達(dá)Cf-vasa的原生殖細(xì)胞形成于原腸胚時(shí)期，在擔(dān)輪幼蟲中對稱分布于口凹兩側(cè)，并隨幼蟲發(fā)育遷移

5、至D型幼蟲末端后，繼續(xù)沿邊緣向腹面遷移。另外，RT-PCR分析檢測到Cf-PL10和Cf-p68在性腺和其它成體組織中都有表達(dá)。增殖期和成熟期性腺的Cf-PL10表達(dá)水平明顯強(qiáng)于外套膜、閉殼肌和鰓，Cf-p68在卵巢中隨性腺發(fā)育成熟表達(dá)漸強(qiáng)，暗示這兩個(gè)基因可能參與了櫛孔扇貝的配子發(fā)生。 boule是DAZ基因家族的一員，編碼一類RNA結(jié)合蛋白，該蛋白調(diào)控減數(shù)分裂起始的功能在進(jìn)化上具有保守性。櫛孔扇貝Cf-boule cDNA從精巢中克隆

6、得到，全長1879 bp，編碼278個(gè)氨基酸的蛋白。Cf-BOULE蛋白具有DAZ家族特有的RNP-1和RNP-2結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)DAZ重復(fù)序列。RT-PCR結(jié)果顯示，Cf-boule在性腺、閉殼肌和外套膜中表達(dá)，性腺中的表達(dá)量明顯高于后者。生長期性腺的表達(dá)水平高于增殖期，卵巢的表達(dá)強(qiáng)于相同發(fā)育階段的精巢。原位雜交結(jié)果進(jìn)一步表明，Cf-boule在除成熟精子外的所有生殖細(xì)胞中都有表達(dá)，推測櫛孔扇貝Cf-boule可能參與調(diào)控精子發(fā)生中的

7、減數(shù)分裂。胚胎和幼蟲的：RT-PCR分析檢測到Cf-boule mRNA含量在受精卵至囊胚的各期胚胎中相似，原腸胚和擔(dān)輪幼蟲中明顯增加，表明櫛孔扇貝早期胚胎中的Cf-boule mRNA是母源性的，原腸胚和擔(dān)輪幼蟲中則有明顯的合子表達(dá)。整體原位雜交結(jié)果顯示，Cf-boule mRNA在受精卵至原腸胚的各期胚胎中彌散分布，與Cf-vasa mRNA的分布差異表明Cf-boule mRNA不作為生殖質(zhì)成分參與櫛孔扇貝原生殖細(xì)胞的形成。擔(dān)輪幼