櫛孔扇貝TGF-β-Smad信號通路基因的克隆、表達(dá)分析及生長性狀相關(guān)SNP位點篩查.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族是一組具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的多功能細(xì)胞因子,在細(xì)胞增殖、分化和生長等生物學(xué)過程中具有重要作用。TGF-β超家族成員首先與細(xì)胞膜表面的II型和I型受體結(jié)合,啟動其信號傳導(dǎo),進(jìn)而激活下游Smad蛋白,將信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本文采用同源克隆、電子克隆等技術(shù),對櫛孔扇貝中TGF-β/Smad信號通路中l(wèi)I個基因進(jìn)行了cDNA和DNA克隆,并運用

2、生物信息學(xué)方法分析了各基因核苷酸和氨基酸序列特征;利用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time qRT-PCR)技術(shù)對11個基因進(jìn)行了表達(dá)分析;通過重測序和EST數(shù)據(jù)庫分析,篩查基因中的SNP位點,用高分辨率熔解曲線技術(shù)(High resolution melting,HRM)對所得SNPs在全同胞家系及野生群體中進(jìn)行了基因分型,并開展了SNP與櫛孔扇貝生長性狀和基因表達(dá)的相關(guān)性分析,為扇貝TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)和相關(guān)基因功能

3、的研究,及生長性狀相關(guān)標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。主要結(jié)果如下:
　　1.獲得了櫛孔扇貝TGF-β超家族配體Myostatin(MSTN)和Bone morphogeneticprotein2(BMP2)及抑制因子Follistatin的cDNA全長及DNA序列,確定了其基因組結(jié)構(gòu)。MSTN和BMP2均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,編碼的氨基酸序列具有信號肽、前肽區(qū)、蛋白酶水解位點(RXXR)、C端成熟區(qū)等TGF-p超家族的典型結(jié)

4、構(gòu)域。對MSTN5’側(cè)翼序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了COMP、MEF2、MTBF和E-box等多個肌肉特異性調(diào)控元件。Follistatin由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,5個外顯子分別編碼信號肽、N端結(jié)構(gòu)域和3個FS結(jié)構(gòu)域。Real-time qRT-PCR結(jié)果顯不,MSTN和BMP2除在原腸胚期有較高水平表達(dá)外,在其它胚胎/幼蟲時期相對表達(dá)量均較低,Follistatin則在受精卵和4細(xì)胞期表達(dá)量較高;3個基因在所測各成體組織均廣泛表達(dá),其中

5、MSTN在橫紋肌中相對表達(dá)量最高,BMP2和Follistatin在鰓中表達(dá)量最高。HRM分析結(jié)果顯示,MSTN中獲得5個、Follistatin中獲得1個具有多態(tài)性的SNP。位于MSTN5,側(cè)翼序列的SNP位點g.-1]63G>T與一個全同胞家系扇貝殼長、殼高、橫紋肌重等生長性狀顯著相關(guān),其中TT型個體殼長、殼高、橫紋肌重顯著高于GT型個體(P<0.05)。野生群體中高橫紋肌量組TT基因型頻率顯著高于低橫紋肌量組(P<0.05)。Re

6、al-time qRT-PCR結(jié)果顯示,上述全同胞家系中GT基因型個體橫紋肌中MSTN表達(dá)量顯著高于GG型和TT型個體(P<0.05)。櫛孔扇貝。MSTN基因高表達(dá)量基因型與低橫紋肌量基因型相同,提示了該基因可能對扇貝橫紋肌的生長起負(fù)調(diào)控作用,與哺乳動物中MSTN在骨骼肌生長發(fā)育過程中的功能相符。
　　2.獲得了絲氨酸/蘇氨酸激酶受體基因.Activin typellreceptor(ActR2)、Activin-like rec

7、eptorl(ALRl)、TGF-βtypelreceptor(TGFBRl)和BMP type lreceptor(BMPRl)的eDNA全長序列,4個基因編碼的氨基酸均具有膜外區(qū)、跨膜區(qū)、激酶區(qū)等TGF-β超家族絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的特征性結(jié)構(gòu)。通過基因組數(shù)據(jù)庫比對確定了ActR2和TGFBRl的基因組結(jié)構(gòu),分別由6個和10個外顯子組成。檢測櫛孔扇貝胚胎/幼蟲不同發(fā)育時期及成體組織中各基因表達(dá)水平,結(jié)果顯示,4個受體基因均在受精卵

8、、4細(xì)胞期和囊胚期有較高表達(dá)量,幼蟲期表達(dá)量較低;各基因在所測組織中均有表達(dá),且性腺和橫紋肌中表達(dá)量較高。此外,在TGFBRl基因3’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)篩得的SNP c.1815C>T與一個全同胞家系扇貝殼長、殼高、橫紋肌重等生長性狀顯著相關(guān),TT型個體的上述三個性狀顯著高于CC型個體(P<0.05)。Real-time qRT-PCR結(jié)果表明,該全同胞家系中CC型個體橫紋肌中TGFBRl表達(dá)量顯

9、著高于TT型個體(P<0.05)。CC型扇貝個體橫紋肌重最低而橫紋肌中TGFBRl表達(dá)量最高,表明TGFBRl可能參與扇貝橫紋肌生長的負(fù)調(diào)控,與哺乳動物中TGFBRl轉(zhuǎn)導(dǎo)的TGF-β信號在肌肉生長中的負(fù)調(diào)控作用相符。
　　3.克隆得到了Smad家族Smadl、Smad3、Smad4和Smad6基因的cDNA全長序列,并確定了其基因組結(jié)構(gòu),分別包含7個、9個、5個和5個外顯子。Smadl、Smad3和Smad6編碼的氨基酸序列均由S

10、mad蛋白家族典型的MHI和MH2兩個結(jié)構(gòu)域組成;但Smad4只含MHl結(jié)構(gòu)域,MH2缺失。表達(dá)分析結(jié)果顯示,櫛孔扇貝胚胎/幼蟲不同發(fā)育時期中,Smadl、Smad3、Smad4和Smad6均在原腸胚期有較高水平的表達(dá),其它時期表達(dá)量較低;各基因在成體組織中廣泛表達(dá),Smadl、Smad3在橫紋肌中表達(dá)量最高,Smad4在性腺中表達(dá)量最高,Smad6則在鰓中表達(dá)量最高。通過數(shù)據(jù)庫比對在Smad3基因編碼區(qū)篩得一個同義突變位點c.846G