CD38在鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞中高表達(dá)并通過(guò)影響ZAP70信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、[目的]
　　通過(guò)對(duì)鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞）的鑒定和生物學(xué)功能研究，探討CD38在鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞中的作用及其可能機(jī)制。
　　[方法]
　　利用貝克曼庫(kù)爾特公司(Beckman Coulter)MoFloTM XDP型超高速細(xì)胞分選平臺(tái)，鑒定、分選鼻咽癌細(xì)胞系SP細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞術(shù)、microRNA芯片、實(shí)時(shí)定量PCR、WesternBlotting等方法，分別從mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平

2、等不同層面，研究鼻咽癌SP細(xì)胞的生物學(xué)特性、CD38在鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞中的表達(dá)水平及其可能作用機(jī)制。
　　[結(jié)果]
　　1.人鼻咽癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞的鑒定及其生物學(xué)特性分析。
　　利用SP細(xì)胞外排熒光活性染料Hoechst33342的特性，我們鑒定了4種鼻咽癌細(xì)胞系HK-1、C666-1、HNE1和HNE2中SP細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK-1和C666-1兩種細(xì)胞系中SP細(xì)胞比例較高，分別為5.2±0.72％和0.46±0

3、.07％，而HNE1和HNE2細(xì)胞系中比例較低，分別為0.01％和0.02％。接下來(lái)我們選擇SP細(xì)胞比例較高的HK-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。SP細(xì)胞因其高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠外排Hoechst33342，我們使用ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米，能夠很好地抑制染料外排作用，從而降低SP細(xì)胞比例。
　　為了進(jìn)一步研究SP細(xì)胞的生物學(xué)特性，本研究利用流式細(xì)胞儀成功分選了SP和NSP(non-side population cell，NSP)

4、細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)CD133、OCT4、ALDH1 A1、CD38等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在SP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。此外，SP細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖和自我更新能力、侵襲和遷移能力、細(xì)胞周期主要分布于G0/G1期等腫瘤干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。
　　2.鼻咽癌HK-1細(xì)胞系中SP和NSP細(xì)胞差異microRNAs表達(dá)譜研究。
　　我們利用microRNA芯片（Agilent Human miRNA芯片18.0版本）檢測(cè)鼻咽癌HK-1細(xì)胞系中SP

5、和NSP細(xì)胞microRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在檢測(cè)的1887個(gè)miRNA分子中，有84個(gè)miRNA分子表達(dá)存在差異，其中有5個(gè)miRNA分子(hsv2-miR-H10，miR-572，miR-3656，miR-638，miR-2861)表達(dá)上調(diào)，79個(gè)miRNA分子（miR-374b-5p，miR-140-5p，miR-1470等）表達(dá)下調(diào)。在差異表達(dá)的microRNAs中有94.05％ microRNAs在SP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。隨后

6、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-634，miR-664，miR-140-5p，miR-4317，miR-3646，miR-582-5p等miRNA分子在鼻咽癌SP和NSP細(xì)胞中存在表達(dá)差異。通過(guò)TargetScan（http://www.targetscan.org）等網(wǎng)站預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)這些差異microRNAs中許多分子與干細(xì)胞標(biāo)志物有關(guān)，如:miR-634,miR-664,miR-140-5p調(diào)控CD38; miR-4317, mi

7、R-3646,miR-582-5p調(diào)控CD24; miR-30a調(diào)控CD133; miR-532調(diào)控CD44;miR-125b調(diào)控CD90等。我們還采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)鼻咽癌SP和NSP細(xì)胞表面及胞內(nèi)干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CD44、CD24、CD38、CK19在SP細(xì)胞表面高表達(dá)，CD133、CD24、CD90、CD38、CD21在SP細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。結(jié)合microRNAs芯片結(jié)果提示，這些差異microRNAs與干細(xì)胞標(biāo)志

8、物蛋白水平的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CD38分子的表達(dá)水平在SP和NSP細(xì)胞中存在較大差異，因此推測(cè)CD38分子介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在SP細(xì)胞中發(fā)揮了生物學(xué)效應(yīng)。
　　3.CD38通過(guò)影響ZAP70信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)
　　CD38通過(guò)多種途徑與CXCR4、CXCL12、CD31、CD49D、MMP-9和ZAP70等分子相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程。我們從mRNA水平檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)CD38分子作用網(wǎng)絡(luò)中CXCR4、Z

9、AP70、CD31、CD49D、MMP-9在SP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其中CXCR4上調(diào)11倍（t=5.355，p=0.0003）、CD31上調(diào)3.3倍(t=3.559，p=0.0061)、CD49D上調(diào)1.5倍(t=2.754，p=0.0362)、MMP-9上調(diào)3.2倍(t=2.602，p=0.0482)、ZAP70上調(diào)1.3倍（t=5.584，p＜0.0001）。隨后我們利用Western Blotting方法檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)CD38及其下游調(diào)

10、控分子ZAP70蛋白在SP細(xì)胞中表達(dá)增高。我們研究結(jié)果提示CD38可能通過(guò)影響ZAP70發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
　　[結(jié)論]
　　(1)成功鑒定鼻咽癌細(xì)胞系HK-1、C666-1中SP細(xì)胞的比例分別為5.2±0.72％和0.46±0.07％;證實(shí)鼻咽癌SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。
　　(2)成功構(gòu)建鼻咽癌SP和NSP細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-634，miR-664，miR-140-5p等miRNA在S