用AFLP-SCAR方法標(biāo)記栽培小麥Brock中抗白粉病新基因.pdf

1、小麥白粉病是一種影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的世界性病害，在我國南北麥區(qū)危害程度日趨嚴(yán)重。由于白粉病抗源的單一和重復(fù)使用，大部分抗白粉病基因已喪失功能。為有效控制白粉病的流行，必須大力挖掘和利用新抗源，并實行抗性基因累加，以培育抗性持久的小麥新品種。 我們以抗白粉病小麥栽培種Brock、對白粉病敏感且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種京411及Brock與015和品種京411雜交、回交7代、自交l代得到的近等基因系(NILs)Brock/015//京41

2、17中選出的抗病優(yōu)良單株為材料，用AFLP方法標(biāo)記普通小麥Brock中的抗白粉病新基因。 1.白粉病抗性鑒定與抗性遺傳用15號白粉菌生理小種對Brock、015、京411及NILs進行抗病性鑒定，親本Brock對白粉菌表現(xiàn)出免疫，品系015及品種京411對白粉菌高度敏感，NILs對白粉菌表現(xiàn)出強抗。Brockx京411的F1代表現(xiàn)為抗病，說明Brock對白粉病的抗性是完全顯性的，屬于細胞核遺傳。F2所鑒定的106個單株中，表現(xiàn)出

3、抗病的有79株，表現(xiàn)出感病的有27株，群體分離比率符合3：1的分離比，再次證實了Brock對白粉菌的抗性屬于顯性單基因遺傳，表明Brock中所含抗性基因是對當(dāng)前北京地區(qū)白粉菌15號優(yōu)勢小種有效的主效抗病基因。 2.Brock中白粉病抗性基因的AFLP分子標(biāo)記篩選利用225個AFLP引物組合對Brock、京411及NILs進行AFLP分析，結(jié)果所有AFLP引物組合均可擴增出清晰可辨的帶型，有效引物比例為100％。大多數(shù)引物都沒有檢

4、測出京411和NILs之間的差異，說明這兩個材料間有極相似的遺傳背景。而Brock與以上兩個樣品間多態(tài)性較高，說明Brock與該兩樣品在遺傳背景上差異較大。所有引物組合中有14對引物在京411與Brock和NILs之間出現(xiàn)21條擴增特異帶。表現(xiàn)為有些擴增帶專屬于京411，在Brock和NILs中擴增不到，如引物組合P6／M3在京411中擴增到約400bp(P6／M3400)和250bp(P6／M3250)兩條特異帶，在Brock和NIL

5、s中沒有擴增到該兩條帶，類似的組合還有P10／M4sso、P10／M2550、P1／M4310。有些譜帶在Brock和NILs中有，而在京411中沒有，如引物組合P10/M7在Brock和NILs中擴增到一條分子量約為1000bp(P10/M71000)的特異帶，京411中沒有此帶；類似的組合還有P6/M3166、P3/M6200、P3/M6500、P6/M7200、P6/M7600、P6/M3190、P6/M6280、P3/M6700

6、、P10/ml0500，P10/M2350，P6/ml480，P6/M2220，P1/M4330，P3/ml300. 3.篩選出的特異片段與白粉病抗性基因的連鎖性分析為檢測這21個特異片段的穩(wěn)定性及其與白粉病抗性基因間的連鎖性和遺傳距離，我們以抗病親本Brock與感病小麥栽培種京411雜交，F(xiàn)1代自交后分離得到了79個抗病單株和27個感病單株，用這28個引物組合對它們進行AFLP分析。結(jié)果表明，只有引物組合P6/M3和P3/M

7、6與抗病基因有較強連鎖性。 4.P6/M3163、P6/M3166、P3/M6395的克隆、測序及序列分析將P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395克隆在大腸桿菌質(zhì)粒pGEMR-T EasyVector上，得到實際長度為163bp、166 bp和395 bp的克隆片段。送往TAKARA生物公司測序，分析測序結(jié)果：在這3個片段中未發(fā)現(xiàn)開放閱讀框，用核苷酸序列同源性比較軟件BLAST在基因核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank中進行

8、同源性比較分析，結(jié)果表明這3個片段與庫中已知基因及序列無同源性。推知P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395是與Brock中抗白粉病新基因緊密連鎖的新標(biāo)記。 5.SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化SCAR marker(sequence characterized amplified region)序列特征化擴增區(qū)域標(biāo)記通常是由RAPD標(biāo)記或AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化而來的。為了提高所找到的某一RAPD或AfLP標(biāo)記在應(yīng)用上的穩(wěn)定性，可將該標(biāo)記

9、片段從凝膠上回收并進行克隆和測序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計一對特異性引物(18～24 bp)，也可只對該標(biāo)記片段的末端進行測序，在原來的10個堿基引物的基礎(chǔ)上增加相鄰的14個左右的堿基，成為與原來標(biāo)記片段末端相配對的特異性引物。根據(jù)P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395的測序結(jié)果分別設(shè)計了一對SCAR引物，SCAR-PCR擴增結(jié)果表明，在抗病單株中出現(xiàn)了特異條帶，在感病單株中沒有出現(xiàn)特異條帶，與AFLP擴增結(jié)果完全一致，成功的將