軟骨干細(xì)胞來源的微囊泡對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、增殖的作用及機(jī)理的研究.pdf

1、研究背景:
　　關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見的骨科疾病，由于關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏修復(fù)機(jī)制，在損傷后難以恢復(fù)原有的組織機(jī)構(gòu)，因此在治療上有較大的困難。近幾年軟骨組織細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)展迅速，被認(rèn)為將能給關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療帶來突破。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類可進(jìn)行自我復(fù)制和更新的細(xì)胞，在不同的理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下能夠跨胚層向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肌肉等多種譜系分化。因?yàn)檫@一特性，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨組織細(xì)胞工程技術(shù)中擔(dān)當(dāng)重要角色，用

2、作種子細(xì)胞，但目還前存在兩方面的問題:
　　(1)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的效率有待提高;
　　(2)形成的軟骨細(xì)胞容易老化。
　　微囊泡(Microvesicle，MV)是由一層界膜和內(nèi)含物組成的微小囊泡，它是細(xì)胞在受到刺激或者凋亡的過程中，由細(xì)胞質(zhì)膜直接向外形成小的突起，進(jìn)而形成芽泡并最終從細(xì)胞質(zhì)膜上脫落形成的。細(xì)胞在形成MV的過程中會(huì)選擇性地將生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA及miRNA等包裹到MV囊

3、腔中或置于膜表面，從而介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息傳遞。已有研究發(fā)現(xiàn)， MV不僅可以促進(jìn)靶細(xì)胞增生分化，而且攜帶抗凋亡因子，可以抑制細(xì)胞凋亡。
　　研究目的：
　　受此啟發(fā)，本研究將利用誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞技術(shù)，將軟骨細(xì)胞反向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞(iPSCs)，再刺激使其產(chǎn)生MV，探討這種MV對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化及增殖的影響，并進(jìn)一步明確其作用機(jī)理，為MV用于軟骨損傷修復(fù)提供有力的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、

4、使用胰酶、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法及貼壁培養(yǎng)法，從4月齡新西蘭大白兔的關(guān)節(jié)軟骨中提取軟骨細(xì)胞，構(gòu)建兔軟骨細(xì)胞系。
　　2、采用慢病毒基因投遞法將4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)導(dǎo)入體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞中，將其重編程為iPSCs。通過熒光顯微鏡觀察其形態(tài)變化和綠色熒光表達(dá)情況;通過RT-PCR的方法檢測(cè)其標(biāo)志性基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanag的表達(dá);通過免疫熒光檢測(cè)標(biāo)志性蛋白Oct4、 S

5、ox2、Nanag、 SSEA-3、SSEA-4、TRA、TRA-1-60、TRA-1-81的表達(dá)。
　　3、采用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、鑒定，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，繪制P3、P5代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　4、條件培養(yǎng)刺激iPSCs分泌MV，并采用經(jīng)典的方法進(jìn)行收集。Zeta電位儀分析MV的粒徑分布，與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)。對(duì)MV進(jìn)行PKH26染

6、色，觀察兔BMSCs對(duì)MV的內(nèi)化。
　　5、MV與兔BMSCs共同培養(yǎng)，觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)變化，通過檢測(cè)CollagenⅡ和Sox9基因表達(dá)判斷BMSCs成軟分化可能性。對(duì)BMSCs進(jìn)行三維培養(yǎng)，檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下BMSCs向軟骨轉(zhuǎn)化的能力。
　　6、檢驗(yàn)MV對(duì)BMSCs增殖作用的影響:(1)MV與BMSCs共育后，采用CCK-8法測(cè)量其生長(zhǎng)曲線，比較不同培養(yǎng)條件下BMSCs的增殖活性。(2)檢驗(yàn)MV對(duì)BMSCs抗凋亡作

7、用的影響，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)不同培養(yǎng)條件下的BMSCs，檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase-3的活性。經(jīng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后的BMSCs繼續(xù)進(jìn)行三維培養(yǎng)21天，Tunel法檢測(cè)BMSCs成軟骨轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞凋亡率。根據(jù)caspase-3被激活的程度和細(xì)胞凋亡率來判斷MV對(duì)BMSCs向軟骨軟化增殖的影響。
　　7、根據(jù)MV對(duì)BMSCs增殖分化的影響，判斷其可能含有的mRNA，并采用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。將MVs經(jīng)過RNase預(yù)處理后，再與BMSCs作用

8、，與未經(jīng)RNase處理組對(duì)比，判段MVs是否是通過傳遞母細(xì)胞特定的mRNA，來影響B(tài)MSCs的增殖與分化的。
　　研究結(jié)果：
　　1、利用胰酶、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法及貼壁培養(yǎng)法，可以成功分離得到兔軟骨細(xì)胞，所構(gòu)建的兔軟骨細(xì)胞系可以滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。
　　2、兔軟骨細(xì)胞被病毒感染后第4天，可見到類似ESC克隆出現(xiàn)，第20天克隆足夠大可以挑克隆以擴(kuò)大培養(yǎng)，預(yù)示著軟骨細(xì)胞已開始重編程。iPSCs生物學(xué)特性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn):第9

9、天可見到有綠色熒光的iPSC克隆出現(xiàn)，AKP染色呈強(qiáng)陽性;表達(dá)ES細(xì)胞特有的標(biāo)志性基因。
　　3、密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合可以分離得到高純度的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明P3-P5代細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛，可用于下一步的研究工作。
　　4、iPCs在特定條件下可以大量分泌MV，Zeta電位檢測(cè)結(jié)果表明我們得到的MV粒徑與文獻(xiàn)報(bào)道一致。PKH26標(biāo)記的MV與BMSCs孵育，2h后可以在BMSCs細(xì)胞檢測(cè)

10、到紅色熒光信號(hào)。14小時(shí)后幾乎每個(gè)BMSCs都顯示紅色熒光。這表明，IPSCs分泌的MV能容易地被BMSCs吸收。
　　5、MV與兔BMSCs共同培養(yǎng)后，BMSCs的形態(tài)逐漸由（形）向軟骨細(xì)胞的（形）變化。Q-PCR結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)條件下 MV處理組中CollagenⅡ和Sox9基因表達(dá)量顯著高于MV未處理組，說明MV的存在，可以大大增強(qiáng)BMSCs向軟骨分化能力。BMSCs三維培養(yǎng)21天后的成軟骨檢測(cè)同樣印證了這一結(jié)論。

11、r>　　6、MV的存在可以明顯提高BMSCs的增殖活性。在相同的培養(yǎng)條件下MV處理組中的BMSCs經(jīng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后，活化的caspase-3表達(dá)量顯著低于MV未處理組。培養(yǎng)環(huán)境為正常培養(yǎng)液還是常規(guī)誘導(dǎo)液，對(duì)BMSCs抗凋亡能力的影響不大。經(jīng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后的BMSCs繼續(xù)進(jìn)行三維培養(yǎng)21天，MV處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于MV未處理組，而培養(yǎng)環(huán)境為正常培養(yǎng)液還是常規(guī)誘導(dǎo)液，對(duì)其沒有明顯的影響。由此判斷MV對(duì)BMSCs增殖有很好的促進(jìn)作用。<

12、br>　　7、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明MV含有SOX9、TGF-B1、FGF、BMP、IGF-1、Bcl-2的mRNA，這些mRNA介導(dǎo)了BMSCs向軟骨轉(zhuǎn)化，并使其具有很好的抗凋亡能力。將MV經(jīng)RNAase處理后，將不具備這樣的能力。
　　研究結(jié)論:
　　通過慢病毒基因投遞法可以將軟骨細(xì)胞重編程為iPSCs，在一定條件下，iPSCs可以分泌大量MVs，所產(chǎn)生的MVs不但可以誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞向軟骨分化，而且可以增強(qiáng)其抗凋亡

13、的能力，延緩誘導(dǎo)生成軟骨細(xì)胞的老化。檢測(cè)MVs成分發(fā)現(xiàn)，含有可以調(diào)控BMSCs轉(zhuǎn)化和凋亡的SOX9、TGF-β1、FGF、BMP、IGF-1、Bcl-2的mRNA，BMSCs通過內(nèi)化MVs，將這些功能的mRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)自身的轉(zhuǎn)化與增殖進(jìn)行調(diào)控。軟骨細(xì)胞重編成iPSCs后，不僅具有干細(xì)胞特性，還保留了原軟骨細(xì)胞的某些特性，可以通過分泌MV的方式，將這些信息傳遞給BMSCs，從而有效促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，本研究結(jié)果將為軟骨-i