腫瘤易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性驗(yàn)證及其基于納米材料的新型檢測(cè)方法研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組的水平上由于單個(gè)核苷酸發(fā)生變異，并由此導(dǎo)致的DNA序列的多態(tài)性。SNP被認(rèn)為是決定人類(lèi)疾病易感性與藥物反應(yīng)差異的一個(gè)確定因素，可導(dǎo)致不同個(gè)體之間對(duì)惡性腫瘤等復(fù)雜疾病的易感性差異，因此對(duì)其檢測(cè)具有重要的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值。
　　兩對(duì)引物-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction with confronting two-

2、pair primer，PCR-CTPP）技術(shù)作為一種SNPs檢測(cè)的新技術(shù)，是在序列特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction with sequence specific primer，PCR-SSP）和多重PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立的。PCR-CTPP技術(shù)的使用有助于臨床和流行病學(xué)大樣本腫瘤易感基因的篩選，同時(shí)對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究、致癌物暴露所引發(fā)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估有極大的幫助。
　　毛細(xì)管電泳（Capi

3、llary Electrophoresis，CE）是繼高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）之后在傳統(tǒng)的平板凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型液相分離技術(shù)。CE以高強(qiáng)度直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，DNA片段因離子表面積和分子外形的差異導(dǎo)致遷移率時(shí)間的不同，從而能夠檢測(cè)SNP。利用CE技術(shù)，可以直接檢測(cè)SNP突變類(lèi)型及其位置。其中，激光誘導(dǎo)熒光（laser induced fluor

4、escence，LIF）方法是目前靈敏度最高、應(yīng)用最廣的一種CE檢測(cè)方式。
　　氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）作為石墨烯的衍生物，易溶于水，具有較好的生物相容性。氧化石墨烯具有熒光猝滅效應(yīng)，基于共振能量轉(zhuǎn)移的原理，通過(guò)檢測(cè)“Fluorescence Off-Fluorescence On”過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子、無(wú)機(jī)小分子的檢測(cè)。
　　基于此，通過(guò)與我校同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院密切合作，我們采用不同的方法

5、驗(yàn)證基因多態(tài)性與相關(guān)腫瘤易感性之間的關(guān)聯(lián)性，在此基礎(chǔ)上嘗試建立了一種基于氧化石墨烯和FITC標(biāo)記的DNA探針（FITC-DNA）通過(guò)CE-LIF對(duì)特定寡核苷酸序列進(jìn)行分離檢測(cè)的方法，論文的完成工作如下：
　?。?）我們基于PCR-CTPP技術(shù)檢測(cè)了DNA修復(fù)基因XRCC1基因SNP多態(tài)性，探討了其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。其基本策略是依據(jù)XRCC1基因三個(gè)不同的SNP位點(diǎn)Arg194Trp（rs1799782）、Arg280

6、His（rs25489）和Arg399Gln（rs25487）來(lái)設(shè)計(jì)兩對(duì)不同的引物，經(jīng)過(guò)一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后進(jìn)行常規(guī)凝膠電泳，之后分析其SNP等位基因。由于引物3‘端堿基為引發(fā)延伸的起點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性，如果有堿基錯(cuò)配發(fā)生，在合適的PCR條件下，擴(kuò)增效率將會(huì)十分低下，而正確的配對(duì)則能夠使PCR擴(kuò)增順利進(jìn)行。通過(guò)病例—對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)：XRCC1密碼子194Trp等位基因?yàn)橹袊?guó)人群神經(jīng)膠質(zhì)瘤高危致病基因，399位Gln等位基因同樣存在著致

7、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這一方法可以用于基因多態(tài)性與腫瘤遺傳易感性的研究，這一工作為研究XRCC1多態(tài)性在中國(guó)人群發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在作用提供了證據(jù)，同時(shí)這種DNA修復(fù)基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)性的分析為深入探討腫瘤致病的遺傳與環(huán)境因素提供了重要的參考。
　?。?）利用Meta薈萃分析方法，探討了在葉酸代謝途徑中基因多態(tài)性研究最多的MTHFR C677T基因與食管癌發(fā)病之間的關(guān)系。雖然此前已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行展開(kāi)，而且研究結(jié)果也表明：M

8、THFR C677T基因與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但是到目前為止，其結(jié)論并不完全一致。本課題利用Meta分析方法，通過(guò)定量合成原始的研究數(shù)據(jù)，其目的是將樣本量加以擴(kuò)大，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行薈萃分析，從而能夠得出更為客觀和更加可信的結(jié)論。通過(guò)分析比較MTHFR C677T雜合基因型（CT）、突變純合基因型（TT）和野生純合型（CC）在病例組及對(duì)照組的分布發(fā)現(xiàn)：攜帶CT基因型的個(gè)體（OR=1.37，95％CI=0.79-1.84）

9、及TT基因型的個(gè)體（OR=1.72，95%CI=1.12-2.43）患食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（P<0.05），這一結(jié)論也支持了MTHFR C677T基因在食管癌發(fā)病過(guò)程中起到了較為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)攜帶MTHFR C677T CT基因型與TT基因型的漢族人群較其他種族人群有著相對(duì)更高的患病風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)也驗(yàn)證了MTHFR C677T TT基因型較CC基因型患病風(fēng)險(xiǎn)更高。
　　（3）以上述驗(yàn)證的中國(guó)人群神經(jīng)膠質(zhì)瘤高危致病基因XRCC

10、1 Arg194Trp的引物序列作為靶標(biāo)序列，嘗試建立了一種基于氧化石墨烯（GO）的毛細(xì)管電泳（CE）-激光誘導(dǎo)熒光LIF檢測(cè)手段，利用FITC-DNA探針對(duì)該特定寡核苷酸序列進(jìn)行分離檢測(cè)的方法。其具體策略為利用GO吸附FITC標(biāo)記的互補(bǔ)DNA探針后淬滅FITC的熒光，再利用FITC-DNA/GO復(fù)合物對(duì)溶液中的該特定寡核苷酸序列T1進(jìn)行識(shí)別，當(dāng)存在靶標(biāo)序列時(shí)，其通過(guò)DNA間的堿基互補(bǔ)配對(duì)將FITC-DNA從氧化石墨烯上解離下來(lái)，形成F