模擬手機(jī)電磁輻射對(duì)正?；蛑嗵钦T導(dǎo)病理狀態(tài)下的SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、第一部分SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　目的：新生SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（spiral ganglion neurons，SGN）的體外原代培養(yǎng)及鑒定。
　　方法：出生1-3天的SD大鼠乳鼠在75％酒精中麻醉5分鐘后斷頭，在解剖顯微鏡下移去雙側(cè)顳骨并打開聽泡，并取出耳蝸蝸軸內(nèi)組織，分離基底膜及血管紋組織，暴露螺旋神經(jīng)組織。在37℃下0.25%胰酶消化螺旋神經(jīng)組織30分鐘并制成細(xì)胞懸液后接種于12孔板培養(yǎng)板

2、，5%CO2/95%O2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SGN使用含10%神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（B27）的DMEM/F12神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基，加入5μmol/l的阿糖胞苷純化細(xì)胞24、48、72h后爬片，鑒定采用TUJ1（Santa Cruz，USA)和NeuN(abcam,USA)抗體，應(yīng)用普通光鏡和激光共聚焦免疫熒光的方法觀察、鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。
　　結(jié)果：在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到SGN接種6小時(shí)后貼壁生長(zhǎng)，早期細(xì)胞軸突不明顯，后期形成長(zhǎng)長(zhǎng)的雙極或

3、三極軸突，胞體呈亮度較高的“橢圓形”(見圖1-1）。采用低濃度阿糖胞苷藥物能去除大部分成纖維細(xì)胞，72h純化程度最高，螺旋細(xì)胞死亡不明顯。激光共聚焦免疫熒光發(fā)現(xiàn)抗體主要表達(dá)在細(xì)胞膜及軸突(見圖1-2，3)。
　　結(jié)論：利用胰酶消化法可以成功的進(jìn)行SD大鼠乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)，5μmol/l阿糖胞苷純化72h后可得到純度較高的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并可以用神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體NeuN和TUJ1鑒定。
　　第二部分模擬手機(jī)電

4、磁輻射對(duì)正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的研究
　　目的：研究常用手機(jī)頻率1800MHz，強(qiáng)度SAR（2和4W/kg)下電磁輻射對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞DNA損傷、超微結(jié)構(gòu)改變、自噬及ROS生成的相關(guān)研究。
　　方法：正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞暴露于1800MHz電磁輻射系統(tǒng)，輻射強(qiáng)度分別設(shè)定為2和4W/kg，選擇開5分鐘關(guān)10分鐘的“手機(jī)通話模式”，暴露時(shí)間為24小時(shí)。采用單個(gè)細(xì)胞電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）觀察電磁輻射對(duì)細(xì)胞DNA有無(wú)損傷，以H2O2作為陽(yáng)性

5、對(duì)照；投射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（線粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）；免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-II的表達(dá)。DCFH-DA試劑盒檢測(cè)ROS生成。
　　結(jié)果：在2和4W/kg強(qiáng)度下，彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果均陰性(見圖2-1）。投射電鏡下線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核及細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)未見明顯異常（見圖2-2），未見溶酶體及自噬小體。4W/kg強(qiáng)度下僅有LC3-II蛋白少量表達(dá)（見圖2-3）；4W/kg和H2O2組

6、ROS生成量高于對(duì)照和2W/kg輻射組（p<0.05,0.01)（見圖2-4）。
　　結(jié)論：短期暴露模式下模擬手機(jī)電磁輻射不能直接引起細(xì)胞DAN損傷；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見顯著改變；在該暴露模式下自噬作用不明顯；4W/kg條件下ROS生成量高于對(duì)照和2W/kg輻射組。電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制之一可能與ROS系統(tǒng)激活有關(guān)。
　　第三部分模擬手機(jī)電磁輻射對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的病理狀態(tài)下SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的研究
　　目的：

7、研究當(dāng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞處于病理狀態(tài)下時(shí)，細(xì)胞對(duì)手機(jī)電磁輻射引起損傷敏感性的變化。
　　方法：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接受不同濃度的脂多糖（0,20,40,50,100,200，400μg/ml）處理后，采用CCK-8及彗星實(shí)驗(yàn)（PH>13）以篩選出適宜的濃度作為輻射前細(xì)胞預(yù)處理濃度（即在該濃度下細(xì)胞活力正常，DNA未見損傷）。40μg/ml被篩選為預(yù)處理濃度。暴露于1800MHz電磁輻射系統(tǒng)，以2和4W/kg為輻射強(qiáng)度，選擇開5分鐘關(guān)10分鐘

8、的“手機(jī)通話模式”，暴露時(shí)間為24小時(shí)。分十個(gè)實(shí)驗(yàn)組：(1)對(duì)照組,(2)2W/kg(暴露和屏蔽組),(3)4 W/kg(暴露和屏蔽組),(4)脂多糖40μg/ml+2 W/kg(暴露和屏蔽組),(5)脂多糖40μg/ml+4 W/kg(暴露和屏蔽組)；（6）H2O2組。暴露結(jié)束后采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷情況；投射電鏡檢測(cè)有無(wú)超微結(jié)構(gòu)改變；激光共聚焦免疫熒光檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3-II蛋白的表達(dá)情況；熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞

9、活性氧（ROS）生成量。
　　結(jié)果：通過CCK-8和彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100μg/ml脂多糖能顯著引起細(xì)胞活性下降及細(xì)胞DNA損傷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，100μg/ml被認(rèn)為引起DNA損傷和細(xì)胞活力受限的臨界濃度（見圖3-1，2）。40μg/ml脂多糖對(duì)細(xì)胞活性及DNA損傷無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，因此將40μg/ml作為預(yù)處理濃度。除了H2O2組，其余組彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性（見圖3-3）。在脂多糖40μg/ml+4 W/k

10、g暴露組電鏡提示超微結(jié)構(gòu)改變，如線粒體空泡化、出現(xiàn)自噬溶酶體、自噬小體；脂多糖40μg/ml+2 W/kg暴露組中電鏡僅發(fā)現(xiàn)有少量自噬溶酶體出現(xiàn)（見圖3-4）。在脂多糖40μg/ml+4 W/kg暴露組自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-II表達(dá)顯著增加，其余組表達(dá)未見顯著增加（見圖3-5）。4W/kg暴露組、脂多糖40μg/ml+4 W/kg暴露組及H2O2組中ROS量較對(duì)照組顯著增加(p＜0.05,0.01)（見圖3-6）。