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1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人正常晶狀體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析姓名:姚志斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):眼科指導(dǎo)教師:張勁松20090401仍按上述步驟進(jìn)行操作,如此反復(fù)三次,合并三次上清液主要為晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分。剩余的沉淀物將其再溶于裂解緩沖液(7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,50raMTrisHCLpn74)中,超聲勻漿(超聲180s),依然按上述方法離心,收集上清液,重復(fù)上述步驟三次,合并三次上清液主要為晶狀體水不溶性
2、蛋白質(zhì)成分l,剩余沉淀物再溶于4%SDS,3%巰基乙醇,50mMTrisC1(pH88)的緩沖液中煮沸5分鐘,超聲勻漿,依然按上述方法離心,收集上清液,重復(fù)上述步驟三次,合并三次上清液主要為晶狀體水不溶性蛋白質(zhì)成分2,最終將剩余的少量沉淀物棄去。應(yīng)用BradFord法(使用牛血清白蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)對(duì)晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分、水不溶性蛋白質(zhì)成分1進(jìn)行蛋白定量后,加入SDSPAGE上樣緩沖液(50mmol/1Tris—HCl,pH83
3、,2%SDS,5%p巰基乙醇和5%甘油)950C加熱5min。配置12%SDSPAGE不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠5%,分離膠12%)初步分離晶狀體蛋白質(zhì):晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分和晶狀體水不溶性蛋白質(zhì)成分1,每泳道各上樣量為15pg。水不溶性蛋白溶液2直接上樣。電泳電流30__45mA,電壓8旺120mV,溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端附近(O51cm)停止電泳。采用考馬斯亮藍(lán)R250染色,染色后SDSPAGE膠圖及切膠位點(diǎn)見附圖3,將每個(gè)條帶的膠
4、分別切成約lmm的小塊,分別放于微量離心管中(碳酸氫氨:乙腈1:1)脫色,加乙腈使膠塊脫水,然后加DTT在56℃下加熱30分鐘還原樣品,再加碘乙酰胺烷基化在暗處30分鐘,凍干,加入測(cè)序級(jí)胰蛋白酶溶液(01mg/m1),于37℃水浴酶解16個(gè)小時(shí),以三氟乙酸(TFA)水溶液提取酶解肽段。酶解肽段分別用輔助泵以30此/min的流速由自動(dòng)采樣器首先進(jìn)樣到3001xrnidx5mmZorbax300SBC18預(yù)柱(AgilentTechnolo
5、gies,WilmingtonDE)上除鹽20min,然后切換到75Innid150n1mRPC18分析柱(毛細(xì)管反相柱,ColumnTechnologyInc)進(jìn)行線性梯度洗脫,流速設(shè)定為20此/min,流動(dòng)相A液為O1%甲酸的水溶液,流動(dòng)相B液為01%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%);045分鐘,4%一50%B液;45~54分鐘,50%100%B液;54“120分鐘,B液維持在100%。分離后的餾分通過(guò)ESI源進(jìn)行LTQ線性離子阱串
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