固氮施氏假單胞菌RNA分子伴侶蛋白Hfq的功能鑒定及表達(dá)特性研究.pdf

1、RNA分子伴侶蛋白Hfq，能夠促進(jìn)蛋白或者非編碼RNA與靶標(biāo)mRNA的互作，調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)眾多代謝過程。已有研究表明Hfq能夠影響固氮微生物植物互作及固氮效率，但其在聯(lián)合固氮菌中的具體功能未見報(bào)道。聯(lián)合固氮施氏假單胞菌A1501中存在Hfq同源蛋白，本研究通過構(gòu)建突變株、測定生理生化表型、表達(dá)純化目的蛋白并進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，對(duì)Hfq的功能及表達(dá)特性進(jìn)行研究。取得了以下結(jié)果:
　　1、在P.stutzeriA15

2、01中存在高度保守的Hfq同源蛋白，為了研究其功能，構(gòu)建了hfq基因的非極性突變株，生長曲線測定結(jié)果表明hfq突變并不影響菌株在LB豐富性培養(yǎng)基和K限制性培養(yǎng)基中的生長能力，但對(duì)氧化脅迫(18mmol/L H2O2處理10min)及滲透脅迫(0.3mol/L山梨醇處理1h)的抵抗能力降低，實(shí)時(shí)定量(Real-time PCR)結(jié)果表明hfq突變后，烷基過氧化氫酶編碼基因ahpFC、過氧化氫酶編碼基因katABEG以及谷胱甘肽過氧化物酶編

3、碼基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)。這與大多數(shù)已報(bào)道的hfq突變株的結(jié)果致。此外，hfq突變后，該菌形成生物膜的能力增強(qiáng)，以亞硝酸鹽為電子受體的反硝化能力減弱，且亞硝酸鹽還原途徑中細(xì)胞色素C-552編碼基因nirB和細(xì)胞色素cd1亞硝酸鹽還原酶前體編碼基因nirS的表達(dá)水平顯著下降（下降約80％），編碼調(diào)控蛋白的nosR基因的表達(dá)量下調(diào)50％。上述結(jié)果表明，Hfq在P.stutzeri A1501中參與了該菌的多種生理過程。
　　2、為了分

4、析Hfq是否參與Pstutzeri A1501的固氮調(diào)控，本研究測定了hfq突變對(duì)菌株固氮能力的影響。結(jié)果表明hfq突變后固氮酶活性顯著下調(diào)（約70％）。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示hfq突變株中，固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifK和固氮調(diào)控基因(nifA、glnA/K、ntrC)以及RNA聚合酶σ54因子編碼基因rpoN的表達(dá)量均下調(diào)。Western blot結(jié)果表明，hfq突變后固氮酶的鉬鐵蛋白NifD、NifK的表達(dá)水平顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，Hfq

5、在P.stutzeriA1501的固氮過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。
　　3、RpoS（又稱σS或σ38），是細(xì)菌在各種脅迫環(huán)境下的全局性調(diào)控蛋白，控制著穩(wěn)定期逆境脅迫相關(guān)的多種基因的表達(dá)，有報(bào)道RpoS調(diào)控hfq的表達(dá)。分析P.stutzeri A1501中hfq啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)存在RpoS蛋白保守結(jié)合位點(diǎn)(TCTATTCTCA)，RT-PCR的結(jié)果也顯示rpoS突變株中hfq的表達(dá)量降低，表明hfq可能為RpoS依賴型。凝